冠心病患者血清lncRNA CHAST的表达和临床意义

曾伟雄,曾金财,方快发

(广东省惠州市第六人民医院心内科 516200)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)是影响人类健康的头号杀手[1-2]。如不及时诊断和治疗，病情会逐步进展导致治疗难度增大，死亡风险增加，部分患者极易发生猝死[3-4]。冠状动脉造影是目前临床诊断冠心病的金标准，但其属于有创检测，且对冠心病早期诊断和病情严重程度评估价值不足，患者接受度不高，因此存在一定局限性[5-6]。

最近研究发现长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)参与动脉粥样硬化、冠心病和高血压等心血管疾病的发生和进展过程，其在循环中可稳定存在并可被检测[7-10]。lncRNA CHAST属于最新鉴定的lncRNA之一，研究显示其参与心力衰竭后左心室的重构过程，参与冠心病患者缺血缺氧心肌细胞应激反应过程，可望成为参与冠心病发病过程的关键lncRNA分子[11-12]。丝氨酸蛋白酶抑制剂A3(serpina3)又称作α-1抗糜蛋白酶，最先鉴定为急性期血浆蛋白酶抑制剂[13]，其在先兆子痫患者循环中水平明显增加，可能与慢性炎症和孕妇血管内皮细胞损伤密切相关[14]。最近研究显示serpina3是主动脉钙化的早期诊断标志物[15]。尽管如此，目前尚无研究探讨冠心病患者血清serpina3水平及其临床意义。本研究探讨冠心病患者循环中lncRNA CHAST和serpina3水平并分析其对冠心病的临床诊断及在预后评估中的价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年7月至2019年7月本院心内科收治的115例冠心病患者作为研究对象。纳入标准[6]：(1)符合2020国际心脏病学会和世界卫生组织(WHO)对冠心病的诊断标准；(2)均行冠状动脉造影检查，至少1支冠状动脉血管狭窄程度大于或等于50%；(3)不存在其他部位癌症或血液系统恶性疾病；(4)临床病历资料完整。排除标准：(1)严重的肝、肾、肺等脏器功能障碍者；(2)合并恶性血液系统疾病或严重免疫系统疾病需要长期药物治疗者；(3)严重精神疾病或存在沟通障碍；(4)既往有冠心病且接受过内科血管重建或外科冠状动脉旁路移植术者；(5)孕妇和哺乳期妇女。115例冠心病患者作为冠心病组，其中男65例，女50例，年龄44～72岁，平均(59.22±6.39)岁；疾病类型：稳定型心绞痛66例，不稳定型心绞痛34例，急性心肌梗死15例；单支、2支和多支血管病变分别有47、33和35例。从同期本院体检科常规健康体检人员中选取年龄和性别相匹配的健康体检者65例为对照组，其中男43例，女22例，年龄44～73岁，平均(57.20±7.23)岁。所有研究对象均签署知情同意书，本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1分组

根据冠状动脉造影结果所得的Gensini评分对冠心病组进行亚组分组。Gensini评分标准[16]：冠状动脉无狭窄为0分，冠状动脉狭窄程度在0～<26%为1分，26%～<51%为2分，51%～<76%为4分，76%～<91%为8分，91%～<100%为16分，而冠状动脉狭窄100%为32分。冠心病患者最终Gensini评分为每例患者的各个分支积分相加。Gensini评分0～25分为轻度病变组，26～49分为中度病变组，≥50分为重度病变组，115例冠心病患者中，轻度病变组32例、中度病变组45例、重度病变组38例。

1.2.2临床标本收集

两组入选的研究对象均采集清晨空腹静脉血，采血时保持平卧位，采集患者外周上肢静脉血8 mL,3 000 r/min在5 ℃离心15 min，分离血清，-80 ℃冰箱保存待统一检测。

1.2.3循环血清lncRNA CHAST表达水平检测

实时荧光定量PCR检测两组循环血清lncRNA CHAST表达水平：按血清/血浆miRNA提取分离试剂盒说明书(德国Qiagen公司)进行RNA提取后检测RNA纯度，选择吸光度1.8～2.1的合格RNA标本,使用QuantiTect逆转录试剂盒(德国Qiagen公司)，从1 μg总RNA中合成cDNA，并将标本保存于-20 ℃冰箱中。采用RealQ Plus 2x Master Mix for Probe(无ROXTM)进行3次重复实时荧光定量PCR检测。反应在Rotor-Gene Q(德国Qiagen公司)上进行,lncRNA CHAST正向引物为5′-TGC TGC ACT TTA CAA CCA CTG-3′,反向引物为5′-ATG GTG TCT TTG ATG TTG GGC-3′,PCR反应参数如下：95 ℃预变性15 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，40个循环。于60 ℃时采集荧光信号，以U6为内参基因。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA CHAST相对表达水平，每份标本均连续测定3次，取平均值。

1.2.4血清serpina3水平检测

采用ELISA检测血清serpina3水平，试剂盒购自北京优尔生科技公司，严格按照试剂盒说明书操作，所有标本统一检测，最小的检测水平为0.01 μg/mL，组间和组内的变异系数分别为3.5%和5.0%。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平比较

冠心病组循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平比较

2.2 不同严重程度冠心病组血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平比较

轻、中、重度病变组血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平比较，差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.3 lncRNA CHAST、serpina3与Gensini评分的相关性分析

Pearson相关性分析示：lncRNA CHAST与Gensini评分呈正相关(r=0.783，P<0.05)，serpina3与Gensini评分呈正相关(r=0.726，P<0.05)，lncRNA CHAST与serpina3也呈正相关(r=0.901，P<0.05)，见图1。

表2 不同严重程度冠心病组血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平比较

A：lncRNA CHAST与Gensini评分的相关性；B：serpina3与Gensini评分的相关性；C：lncRNA CHAST与serpina3的相关性。

2.4 lncRNA CHAST、serpina3对冠心病的诊断价值分析

ROC曲线分析显示，当lncRNA CHAST的最佳截断值为0.92时，曲线下面积(AUC)为0.801(95%CI：0.765～0.847，P<0.001),灵敏度为75.1%，特异度为87.9%。当serpina3的最佳截断值为99.37 μg/mL时，AUC为0.914(95%CI：0.876～0.946，P<0.001),灵敏度为87.1%，特异度为93.9%。二者联合诊断冠心病的AUC为0.946(95%CI：0.897～0.982,P<0.001),灵敏度为91.1%，特异度为97.9%，见图2。

图2 lncRNA CHAST、serpina3对冠心病诊断的ROC曲线

3 讨 论

近年来我国冠心病发病率和病死率均逐年上升，且发病年龄更趋于年轻化[17]。鉴于我国人口基数巨大，研究显示每年因冠心病死亡的人数高达700万人，给家庭和社会造成巨大的负担[18]。如何早期有效对冠心病患者进行诊断，并对其病情进展进行有效监测显得尤为重要，是降低患者潜在血管事件发生及改善预后的重要途径[18]。

lncRNA可通过调控多种细胞的增殖、凋亡、损伤、自噬[19]和分化等过程[20],进而在心血管疾病的发生、发展过程中发挥重要作用[21]。lncRNA CHAST定位在人类染色体7q32.2上，以细胞溶质﹑核可溶物和染色质相关形式广泛存在[22]。也可被激活的T细胞信号的核因子所激活。缺血再灌注损伤和永久性梗死后，心肌细胞中活化T细胞核因子的核易位增加[11]。本研究显示冠心病患者血清lncRNA CHAST表达水平明显高于对照组，其表达水平在不同严重程度的冠心病患者中存在明显差异，且随着疾病的进展，表达水平呈增加的趋势。有研究报道，在急性心肌梗死患者血清lncRNA CHAST表达水平较对照组明显增加，特别是在心肌梗死早期改变最为明显[12]，提示可能和心肌缺血密切相关，其水平和心肌梗死患者左心室射血分数呈正相关，在心肌梗死的恢复期，其表达水平逐步下降。尽管冠心病患者血清lncRNA CHAST表达水平增加的机制尚不清楚，推测可能为冠心病的心肌细胞在缺血缺氧刺激下导致其表达水平增高。

serpina3是位于14q32上编码的约为3.0×109的蛋白质，是由人体肝、心、肺和肾脏组织和细胞合成的急性期蛋白[23]。有研究显示其可参与慢性阻塞性肺疾病、帕金森病、脑出血和多发性系统性萎缩疾病的发展[24]。有研究报道在动脉粥样硬化病变中，serpina3水平增加，在轻度卒中或短暂性脑缺血发作的患者中serpina3水平增加更为明显[25]。本研究显示冠心病患者血清serpina3水平高于对照组，随着冠心病患者Gensini评分增加，serpina3水平明显增加，在不同严重程度的冠心病患者中存在明显差异，提示其可作为评估冠心病患者病情严重程度的有效指标。文献报道显示，与对照组比较，急性心肌梗死患者基础血浆serpina3水平升高[26]。急性心肌梗死后激活的嗜中性白细胞和肥大细胞衍生蛋白，产生炎性因子瀑布效应，可能调节心肌细胞对于serpina3的表达[26]。在心肌梗死的血管平滑肌细胞中serpina3水平也明显增加，其可能是在冠心病患者的缺血心肌细胞和供应心脏血供的微循环中，血管平滑肌细胞serpina3水平增加导致冠心病患者血清循环的serpina3水平增加[27]。

本研究发现随着冠心病严重程度增加，冠状动脉造影所得的Gensini评分增加[28]，发现冠心病患者循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平也逐渐增加，Gensini评分增加和循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平呈正相关，同时冠心病循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平也呈正相关，上述结果显示冠心病循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平可作为评价冠心病严重程度的潜在的生物标志物，临床上可通过检测循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3浓度来评估冠心病的严重程度。

ROC曲线分析显示通过检测循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3浓度均能够很好地区分是否为冠心病患者，二者诊断冠心病患者的ROC曲线的AUC值分别为0.801和0.914，而两者联合检测的ROC曲线AUC值可达0.946，上述结果提示循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3浓度对冠心病具有较好的诊断效能，其相对于冠心病其他诊断手段如冠状动脉造影，具有无创的优势。

综上所述，冠心病患者循环血清lncRNA CHAST表达水平和serpina3浓度均明显高于健康对照人群，单独和联合检测lncRNA CHAST表达水平和serpina3水平可对冠心病进行早期诊断和病情严重程度评估，二者可能成为冠心病患者潜在的无创生物标志物。