柿脱涩过程中褐变及相关酶活性的变化规律

韩卫娟，曹 坤，傅建敏，王艺儒，张嘉嘉，李树战

(1 国家林业和草原局泡桐研究开发中心 经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，河南 郑州 450003；2 中南林业科技大学 经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004)

柿(DiospyroskakiThunb.)为柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros)植物，是我国重要的六大木本粮油树种之一，果实色泽鲜艳，风味甜美，营养丰富，具有重要的经济、生态和社会价值[1]。据2018年联合国粮农组织统计，我国柿栽培面积约98.15万hm2，年产量达421.64万t，均居世界之首，分别占世界的91.32%和73.32%。然而除大别山区有极少量的完全甜柿外，我国其他柿资源均为完全涩柿类型，暂未发现不完全甜柿和不完全涩柿类型[2]。涩柿果实硬熟期可溶性单宁含量仍高于可食用阈值2 mg/g[3]，须人工脱涩后方可食用。

传统的脱涩方法主要是通过促进果实的后熟过程来达到脱涩效果，只有果实变软后其涩味才能降至可食用程度，不仅脱涩周期长而且果实变软后极不耐贮运，严重降低了鲜食柿果实的商品价值，进而导致柿资源大量浪费[3]。因此，需要在柿果实成熟后进行快速人工脱涩，并保持果实硬度。目前脱涩保硬的方法主要有N2脱涩、CO2脱涩、温水脱涩等，其中CO2脱涩技术最为成熟，可大规模标准化应用于鲜食柿产业[4-5]。日本成功运用该技术对‘平核无’和‘刀根早生’2个涩柿品种进行了大规模脱涩；但是，我国多数主栽涩柿品种在CO2脱涩过程中均出现不同程度的褐变现象[6-7]。前期研究表明，可溶性固形物含量越高、风味越香甜的涩柿品种，越容易发生褐变[7]，如‘磨盘柿’、‘八月黄’、‘火晶’、‘中柿1号’、‘恭城月柿’等国内优良品种，在脱涩过程中褐变现象严重，严重限制了CO2脱涩技术在我国的推广，成为制约我国鲜食涩柿产业发展的瓶颈。

褐变是影响果蔬采后外观品质最为突出的问题之一，尤其是对颜色较浅的果蔬影响更为显著[8]，主要表现为果蔬原有颜色变暗或变为褐色[9]，这在苹果、梨、菠萝、荔枝和柿等水果中均有报道[9-13]，极大地影响了果蔬的商品价值。褐变按其发生机制主要分为酶促褐变和非酶促褐变，现在普遍认为水果的组织褐变是酚类物质酶促氧化的结果[10]。果实发生酶促褐变有三大先决条件：褐变底物(酚类化合物)、多酚氧化酶和O2[14]。柿果实褐变的研究主要集中在果实鲜切加工、机械损伤以及热水处理[13]方面，有关CO2脱涩处理引起柿果实褐变的原因尚未见系统报道。

本研究以极易褐变种质‘中柿1号’为试验材料，通过测定不同褐变等级果实的硬度，单宁、总酚、黄酮、抗坏血酸和丙二醛(MDA)含量以及多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等褐变相关酶活性，探讨CO2脱涩处理对柿果实生理生化品质的影响，以期揭示涩柿果实CO2脱涩过程中褐变发生的内在机制，为促进柿产业健康快速发展提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以国家林业和草原局泡桐研究开发中心选育的极易褐变柿品种‘中柿1号’的果实为试验材料。2018年10月于果实商熟期在国家林业和草原局泡桐研究开发中心孟州试验基地(112°42′58″ E，34°51′38″ N)，选择6株树势健壮、无病虫害的无性系单株从东南西北4个方向进行样品采集，每株采集20个果实低温冷藏带回实验室备用。

1.2 样品处理

挑选100个大小均一、颜色均匀、无病虫害的果实，随机分为2组，即对照组和CO2脱涩组。(1)对照组。果实于25 ℃、相对湿度90%条件下放置48 h；(2)CO2脱涩组。参照孙鹏等[3]的方法，将果实装入由厚度60 μm塑料膜制成的塑料袋内，通过连接胶管将纯度为99.999 9%食品级CO2充入塑料袋内，将管口伸入塑料袋底部，持续充入CO2直到封口处排出的气体能迅速熄灭火焰，然后再持续充入20 s, 之后迅速封闭袋口；25 ℃、相对湿度90%条件下脱涩处理24 h，打开袋口，将果实自然暴露于大气中，同条件下继续脱涩24 h。脱涩后的果实根据褐变面积分为3个等级：T1.褐变面积25%～49%；T2.褐变面积50%～75%；T3.褐变面积≥75%。对照组果实视为未褐变对照(CK)，CK、T1、T2和T3均随机取10个果实，测定果实硬度和色泽后，将果肉切碎经液氮速冻于-80 ℃保存，用于生理生化指标及酶活性分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生理生化指标 可溶性单宁和不溶性单宁含量测定参考余轩[15]的Folin-Ciocalteu法，以单宁酸为标准品，725 nm处测定吸光度，总单宁含量为可溶性单宁含量和不溶性单宁含量之和；果实硬度和果皮颜色分别采用果实硬度计(LX-A，上海伦捷)和CR-400(Konica Minolta，日本)色差仪进行测定；丙二醛含量测定采用硫代巴比妥酸法[16]；总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法[17]，以没食子酸为标准品，765 nm处测定吸光度，样品中总酚含量以没食子酸计；抗坏血酸含量按照张嘉嘉等[18]的方法测定，采用30 g/L偏磷酸及体积分数8%的冰醋酸研磨提取，0.22 μm微孔滤膜抽滤后进行色谱分析；总黄酮含量测定采用AlCl3-(HAc-NaAc)法[17]，以芦丁为标准品，400 nm处测定吸光度，样品中总黄酮含量以芦丁计。

1.3.2 酶活性 多酚氧化酶(PPO)活性测定采用邻苯二酚法[19]，以每克果肉每分钟吸光度变化值增加1为1个酶活性单位(U)。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)比色法[19]，以每克果肉每分钟反应体系对NBT光化还原的抑制达50%时为1个SOD酶活性单位(U)。过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法[20]，以每克果肉每分钟吸光度值增加1为1个POD酶活性单位(U)。过氧化氢酶(CAT)活性测定采用Duan[21]的方法，以每克样品每分钟吸光度变化值减少0.01为1个CAT酶活性单位(U)。

1.4 数据统计与分析

利用Excel软件计算平均值、标准偏差、线性回归方程等；利用SPSS 20.0进行方差分析、Duncan’s多重比较(P<0.05水平)、Pearson相关性分析；采用Origin 2018制图。

2 结果与分析

2.1 柿脱涩过程中褐变与单宁含量的关系

‘中柿1号’果实脱涩处理后3个褐变等级T1、T2、T3及对照的果实外观见图1。褐变前后可溶性单宁与不溶性单宁含量变化如图2所示。

图1 ‘中柿1号’对照(CK)与不同褐变程度果实(T1、T2和T3)的外观Fig.1 Control (CK) and different browning grades (T1,T2 and T3) of ‘Zhongshi No.1’ fruit

同一指标上标不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。下同Different letters indicate significant differences at P<0.05.The same below图2 柿果CO2脱涩褐变过程中单宁含量的变化规律Fig.2 Changes of tannin content in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

由图2可知，CO2脱涩处理后，果实可溶性单宁含量显著下降，从(14.31±0.06) mg/g(CK)降至(1.19±0.02) mg/g(T1)，低于可食用阈值2 mg/g[3]，达到可食用水平，说明CO2脱涩法能够有效脱除柿果的涩味。CK、T1、T2、T3柿果实中不溶性单宁含量差异显著(P<0.05)，分别为(1.64±0.13)，(9.22±0.21)，(7.47±0.19)，(9.84±0.25)mg/g，表明随着可溶性单宁含量的逐渐下降，不溶性单宁含量不断升高，这可能是由于高CO2低O2环境迫使果实进行无氧呼吸产生乙醇，乙醇又进一步氧化产生乙醛，诱导果实中的可溶性单宁转化为不溶性单宁[22]，导致可溶性单宁含量下降，不溶性单宁含量上升。CK、T1、T2、T3柿果实中总单宁含量分别为(15.88±0.03)，(10.41±0.23)，(9.40±0.30)和(11.44±0.41) mg/g，可以看出果实褐变总单宁含量逐渐减少，这可能是单宁作为底物参与了褐变反应引起的[23]。

2.2 褐变对涩柿果实硬度、色泽的影响

‘中柿1号’果实脱涩过程中硬度和色泽的变化如表1所示。由表1可知，果实褐变后硬度显著下降(P<0.05)，CK、T1、T2、T3柿果实硬度分别为24.11， 5.77， 2.64和0.38 N；与CK相比，T1果实硬度急剧下降，表明褐变现象对果实硬度影响显著；从T1到T3，果实硬度逐渐降低，说明褐变越严重对果实硬度的影响越大。果皮色泽是反映果实品质的重要指标，从表1可以看出，柿果褐变过程中，其明亮度L*值、色相a*和b*值均呈显著下降趋势，其中T1果实果皮色泽变化最大，说明褐变现象会导致柿果实色泽变暗，且褐变程度越严重，色泽越深。

表1 柿果CO2脱涩褐变过程中硬度、L*、a*和b*值的变化规律Table 1 Changes of firmness,L*,a* and b* in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.3 柿果脱涩过程中丙二醛、总酚含量及PPO活性的变化

由图3-A可见，与CK相比，T1、T2和T3柿果实MDA含量显著上升，其中T3果实MDA含量升至7.26 nmol/g，说明脱涩处理的低O2环境引起柿果实组织细胞代谢失调，进而导致细胞内区域性分布受到破坏。柿果实褐变后其总酚含量显著下降(图3-B)，且随着褐变程度加剧总酚含量呈持续下降的变化趋势，CK、T1、T2、T3柿果实总酚含量分别为13.19， 7.25， 4.76和0.98 mg/g，不同褐变等级间均有显著性差异，说明褐变对‘中柿1号’柿果肉组织的总酚含量影响显著。CO2脱涩处理后，多酚氧化酶(PPO)活性先显著上升，从3.77 U/g(CK)升至22.22 U/g(T1)，活性增强约6倍；随着果实褐变程度加重，PPO酶活性呈逐渐下降的变化趋势，T3果实降至2.82 U/g，显著低于CK(图3-B)。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).The same below图3 柿果CO2脱涩褐变过程中MDA含量(A)、总酚含量和PPO活性(B)的变化规律Fig.3 Changes of MDA content (A) and total phenolics content and PPO activity (B) in browning process after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.4 柿果脱涩褐变与生理生化指标和酶活性的关系

如图4-A所示，CK、T1、T2、T3柿果实抗坏血酸含量分别为(7.38±0.08)，(14.31±0.06)，(10.48±0.03)和(10.67±0.01) mg/hg，与总黄酮含量变化趋势一致，均呈现先上升后下降的变化趋势。由图4-B可知，褐变发生后柿果实SOD、POD、CAT活性急剧上升(P<0.05)，T1时达到最大值，分别为6.14， 22.95， 53.00 U/g；但随着果实褐变程度加剧，SOD、POD、CAT活性逐渐降低，但均显著高于CK。上述研究结果表明，黄酮和抗坏血酸作为非酶抗氧化系统，SOD、POD、CAT等作为酶类抗氧化系统,均起到了清除活性氧、维持果实内部氧化还原平衡状态的作用，因此在果实褐变初期呈现急剧上升趋势；但随着低O2胁迫的持续，自身抗氧化系统不足以抵抗低O2胁迫，进而导致果实褐变程度加剧。

图4 柿CO2脱涩褐变过程中抗氧化指标的变化规律Fig.4 Changes of ascorbic acid and total flavonoids contents (A) and SOD,POD and CAT enzyme activities (B) in browning after CO2 deastringency treatment of persimmon fruit

2.5 柿果脱涩前后生理生化指标与酶活性的相关性

‘中柿1号’果实脱涩前后生理生化指标与酶活性的Pearson相关性分析结果如表2所示。

表2 ‘中柿1号’脱涩前后果实生理生化指标与酶活性的Pearson相关性分析Table 2 Pearson correlation coefficients of physiological and biochemical indexes and enzyme activity before and after deastringency of ‘Zhongshi No.1’ fruit

由表2可知，果实硬度与可溶性单宁含量、L*、a*、b*值呈显著或极显著正相关关系，说明伴随着果实色泽的改变果实硬度也在变化，且与可溶性单宁含量在褐变过程中的变化有关；可溶性单宁含量与不溶性单宁含量呈显著负相关关系，进一步说明CO2脱涩能诱导果实中的可溶性单宁转化为不溶性单宁；L*、b*值与可溶性单宁含量呈显著正相关关系，a*值与总酚含量呈显著正相关关系，L*值与不溶性单宁含量呈显著负相关关系，说明褐变后果实色泽变化与可溶性单宁、不溶性单宁及总酚含量的变化相关，这可能与酚类物质作为酶促褐变的反应底物，被氧化后聚合成褐色物质有关[24]；抗坏血酸含量与POD、CAT活性之间存在显著正相关关系，说明果实褐变发生后，抗坏血酸、POD和CAT能协同清除活性氧等有害物质。

3 讨论与结论

本研究表明，CO2脱涩处理后柿果实可溶性单宁含量迅速降至可食用阈值以下，达到可食用水平，说明CO2脱涩法能有效、快速脱除柿果实的涩味。可溶性单宁含量下降伴随着不溶性单宁含量升高，这可能是由于高CO2低O2环境迫使果实进行无氧呼吸产生乙醇，乙醇进一步氧化产生乙醛，进而诱导果实中的可溶性单宁转化为不溶性单宁[22]。此外，果实硬度和色泽是衡量果实成熟和贮藏品质的重要指标之一[25]，‘中柿1号’柿果实褐变发生后，硬度、色泽值均显著下降，且褐变越严重，果实硬度值越小、色泽越暗。果实硬度、L*、b*值均与可溶性单宁含量呈显著正相关关系，说明单宁含量的变化可能是引起柿果实CO2脱涩过程中褐变的因素之一。

当柿果实暴露于高CO2低O2环境中时，低O2环境会诱发果实的氧化应激反应，导致果肉组织活性氧水平上升，影响细胞的正常代谢，进而导致生理失调，引起果实褐变[26]。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其积累水平可作为组织细胞受伤害和生理衰老褐变的重要指标[27]。酚类物质是酶促褐变的反应底物，PPO是催化褐变反应的关键酶[28]。本研究表明，脱涩处理后的‘中柿1号’果实MDA含量显著上升，说明高CO2低O2环境引起柿果实组织细胞的代谢失调，进而导致细胞内的区域性分布受到破坏；果实褐变后总酚、总单宁含量快速下降，PPO活性急剧上升，之后随着果实褐变程度加重又逐渐下降，表明高CO2低O2环境增加了酚类化合物与PPO的接触机会，导致酚类物质氧化，进而引起果实褐变。随着果实褐变程度加剧，底物逐渐被消耗，PPO活性也逐渐降低。对荔枝采后贮藏过程的研究发现，随着果实褐变，总酚含量明显下降[21]；寇莉苹等[23]对富士苹果贮藏期间果肉褐变发生的生化特性进行研究发现，随着褐变程度加重，单宁含量下降速度加快；何瑛等[29]发现石榴皮褐变底物为单宁；陶月良等[30]也发现栗子种子褐变底物为单宁；Larrigaudiere等[31]研究表明，梨果实出现轻微褐变时，PPO活性增高，随着褐变等级加深，PPO活性降低至起始水平，这些研究结果均与本研究结果一致。