酶联免疫试剂盒复核验证分析

文│王远丽（新疆维吾尔自治区昌吉回族自治州畜产品质量检测中心）

周俊晟［新疆维吾尔自治区吉木萨尔县北庭镇农（牧）业发展服务中心］

笔者对北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦公司）和北京华安麦科生物技术有限公司（以下简称华安麦科）开发的氯霉素酶联免疫试剂盒展开复核验证试验，主要复核指标包括试剂盒的50%抑制浓度、样本最低检测限、准确度和精密度。

一、材料和检测方法

1.试剂。乙酸乙脂、正已烷、去离子水。

2.材料。勤邦公司氯霉素编号：KA00605H酶联免疫试剂盒（批号为：C190503A10、C201103A10、C210103A10）；华安麦科氯霉素编号：HE09001酶联免疫试剂盒（批号为：20200312、20201203、20210107）。

3.检测仪器。微孔板酶标仪450纳米/630纳米、氮气吹干装置、均质器、涡旋仪、离心机、刻度移液管、微量移液器（单道20～200微升、100～1000微升、多道300微升）等。

4.操作方法。根据勤邦公司和华安麦科所提供的试剂盒说明书，对生鲜乳样本进行试剂盒灵敏度、样本最低检测限、准确度和精密度的复核实验。

5.试剂盒操作过程。

勤邦公司酶联免疫试剂盒标准曲线浓度分为0、0.025微克/毫升、0.075微克/毫升、0.3微克/毫升、1.2微克/毫升、4.8微克/毫升，样品前处理过程中稀释0.5倍；量取2毫升新鲜牛奶样本至50毫升聚苯乙烯离心管中，分别加入50微升蛋白沉淀剂和8毫升乙酸乙脂，用涡旋仪涡动30秒混匀，3000转/分钟，离心5分钟；吸取4毫升上层有机相至10毫升洁净干燥玻璃管，于50～60℃（122～140℉）水浴氮气流下吹干；加入0.5毫升正已烷，用涡旋仪涡动1分钟，再加入0.5毫升复溶工作液，用涡旋仪涡动30秒，混匀；将所有液体转移至2毫升聚苯乙烯离心管中，3000转/分钟，离心5分钟；除去上层有机相，取下层水相50微升用于分析。

华安麦科酶联免疫试剂盒标准曲线浓度分为0、0.01微克/毫升、0.03微克/毫升、0.09微克/毫升、0.27微克/毫升、0.81微克/毫升，样品前处理过程中稀释4倍；将生鲜乳样本于25℃放置1小时左右，待样本回温；室温4000转/分钟，离心5分钟；移去上层脂肪，取500微升下层奶样，加入1.5毫升生鲜乳样本稀释液，振荡混匀后，取70微升用于分析。

二、复核验证结果

1.50%抑制浓度测定。测定标准曲线0浓度标准溶液50%抑制率处所对应的药物浓度IC50值，以此作为评价勤邦公司试剂盒灵敏度、标准曲线及稳定性的性能指标。

验证过程中，分别测定试剂盒标准曲线6条，用分析软件计算6条标准曲线IC50值，及IC50波动范围，结果见表1和表2。

表1 勤邦公司酶联免疫试剂盒IC50值 微克/毫升

表2 华安公司酶联免疫试剂盒IC50值 微克/毫升

从测定数据可知，勤邦公司酶联免疫试剂盒IC50平均值为0.142微克/毫升，波动范围在0.104～0.187微克/毫升。华安麦科酶联免疫试剂盒IC50平均值为0.062微克/毫升，波动范围在0.053～0.067微克/毫升。

2.样本最低检测限测定。测定生鲜乳空白样品，计算最低检测限。

检测限计算公式为：LOD＝X＋3×SD。其中，X为重复测定空白样品的平均值，SD为重复测定空白样品的标准偏差，其中X为重复测定空白样品的平均值，n为样品数量，结果见表3和表4。

表3 勤邦公司酶联免疫空白生鲜乳样本最低检测限 微克/毫升

表4 华安公司酶联免疫空白生鲜乳样本最低检测限 纳克/毫升

实验数据分析，勤邦公司酶联免疫试剂盒空白生鲜乳样本最低检测限为：14.2纳克/毫升。华安麦科酶联免疫试剂盒空白生鲜乳样本最低检测限为：82.1纳克/毫升。

3.试剂盒准确度和精密度测定。将氯霉素添加至生鲜乳样本至终浓度分别为0.05微克/毫升、0.1微克/毫升、0.5微克/毫升，每个浓度测定5个重复，对测定结果计算回收率及变异系数，结果见表5和表6。

表5 勤邦公司酶联免疫试剂盒回收率和变异系数情况 微克/毫升

表6 华安麦科酶联免疫试剂盒回收率和变异系数情况 微克/毫升

结果表明，勤邦公司酶联免疫试剂盒空白生鲜乳在三个添加水平的回收率范围为88.2%～115.3%，批内变异系数范围为6.3%～9%，批间变异系数为7.7%～8.9%。华安麦科空白酶联免疫试剂盒生鲜乳在三个添加水平的回收率范围为78.2%～117%，批内变异系数范围为5.1%～9.7%，批间变异系数为6%～8%。

三、结果讨论

通过对以上复核检测结果得出：

1.勤邦公司酶联免疫试剂盒IC50平均值为0.142微克/毫升，波动范围在0.104～0.187微克/毫升之间。华安麦科酶联免疫试剂盒IC50平均值为0.062微克/毫升，波动范围在0.053～0.067微克/毫升。

2.勤邦公司生鲜乳最低检测限为：14.2纳克/毫升。华安麦科生鲜乳最低检测限为：82.1纳克/毫升。

3.勤邦公司酶联免疫试剂盒空白生鲜乳在三个添加水平的回收率范围为88.2%～115.3%，批内变异系数范围为6.3%～9%，批间变异系数为7.7%～8.9%。华安麦科酶联免疫试剂盒空白生鲜乳在三个添加水平的回收率范围为78.2%～117%，批内变异系数范围为5.1%～9.7%，批间变异系数为6%～8%。

4.勤邦公司、华安麦科生产的氯霉素酶联免疫试剂盒均符合相关要求。