奥贝胆酸关键中间体杂质的设计与合成

魏 霞, 文小清, 母慧聪, 黄晴菲, 张 燕*, 王启卫1,*

(1.中国科学院 成都有机化学研究所，四川 成都 610041；2.中国科学院大学，北京 100049；3.西华大学 理学院，四川 成都 610039)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liverdisease，NAFLD)已成为全球第一大慢性肝脏疾病[1-6]。奥贝胆酸(商标为Ocaliva)是一流的法尼类X受体(FXR)激动剂，用于治疗原发性胆汁肝硬化非酒精性脂肪性肝病的有效药物，其市场价值巨大[7-9]。

化学药物的杂质是指存在于原料药中，但化学结构与原料药不同的任何一种成分。药品质量的高低与人们的生命健康安全有着密切的关系。因此杂质合成研究在药物质量研究控制中占有重要地位，需对原料药进行全面的杂质谱研究和控制[10-15]。

本文以易得的3-α-乙酰基-6-β-乙烯基-7-酮石胆酸甲酯为原料，先氢化制得中间体3-α-乙酰基-6-β-乙基-7-酮石胆酸甲酯(6)[16]；在碱性条件下脱保护，同时6位乙基发生构型翻转得到中间体6-α-乙基-7-酮石胆酸(7)；如6-位不发生翻转，产生中间体7的非对映异构体杂质6-β-乙基-7-酮石胆酸(A)；水解脱除保护基时，通过控制碱的浓度就可获得具有不同构型的6-位取代的化合物A和化合物7；再由化合物A和化合物7，经酯化或者乙酰化，就可得到杂质B、杂质C、杂质D或杂质E(Scheme 1)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance-300 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Bruker LC-QTOF型高分辨质谱仪；Waters 515 型高效液相色谱仪。

所用试剂均为分析纯。

1.2 合成

(1)6-β-乙基-7-酮石胆酸(A)的合成

称取中间体625.00 g(0.053 mol)，溶解于290 mL混合溶液(四氢呋喃/甲醇=1/1,V/V)中，完全溶解后，加入1 M NaOH水溶液100 mL，室温下反应2.5 h(TLC检测)。反应完全后蒸干溶剂，残余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液调节pH为3，用水(3×200 mL)洗涤，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=5/1,V/V)纯化得白色固体A17.8 g，收率81%，HPLC纯度98.7%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.47(m, 1H), 2.47(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.27(m, 1H), 2.20～1.99(m, 2H), 1.96～1.81(m, 3H), 1.81～1.50(m, 7H), 1.37(m,J=9.0 Hz, 5.4 Hz, 4H), 1.25(m, 2H), 1.18～0.98(m, 7H), 0.86(d,J=6.3 Hz, 3H), 0.81～0.68(m, 3H), 0.60(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.40, 176.55, 70.15, 61.98, 54.69, 49.46, 48.55, 45.42, 42.70, 42.34, 39.84, 38.65, 35.67～34.74, 30.88, 29.32, 28.02, 26.43, 25.82, 24.77, 21.25, 18.21, 12.93, 11.94; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C26H42O4Na {[M+Na]+}441.2975, found 441.2964。

(2)6-β-乙基-7-酮-石胆酸甲酯(B)的合成

称取A5.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL 甲醇中，完全溶解后，缓慢滴加3 mL浓硫酸至反应液,室温下反应1 h(TLC检测)。反应完全后蒸干溶剂，残余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗涤，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)纯化得白色泡沫状固体B2.96 g，收率57%，HPLC纯度99.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.65(s, 3H), 3.55(s, 1H), 2.55(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.35(m, 1H), 2.27～2.06(m, 1H), 2.04～1.85(m, 3H), 1.70(m, 8H), 1.54～1.23(m, 4H), 1.23～1.02(m, 4H), 0.91(d,J=6.2 Hz, 3H), 0.83(m, 3H), 0.66(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.46, 174.68, 70.62, 62.08, 54.78, 51.47, 49.59, 48.68, 45.56, 42.89, 42.50, 39.82, 38.79, 35.58, 35.34, 35.22, 31.03, 30.97, 29.55, 28.17, 26.59, 25.95, 24.90, 21.42, 18.33, 13.06, 12.08; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3118。

(3)3-α-乙酰基-6-β-乙基-7-酮石胆酸(C)的合成

依次称取A5.00 g(0.012 mol)，NaHCO320.00 g(0.238 mol)，乙酸酐20 mL(0.210 mol)溶解于200 mL 四氢呋喃中，65 ℃下回流搅拌12 h(TLC检测)。反应完全后蒸干溶剂，残余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液调节pH为5，用水(3×200 mL)洗涤，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)纯化得白色固体C1.82 g，收率33%，HPLC纯度98.3%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 6.11(s, 2H), 4.65(m, 1H), 2.56(t,J=11.3 Hz, 1H), 2.47～2.07(m, 3H), 2.06～1.87(m, 6H), 1.86～1.56(m, 7H), 1.56～1.02(m, 14H), 0.92(d,J=6.1 Hz, 4H), 0.84(q,J=6.2 Hz, 3H), 0.67(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 215.30, 179.87, 170.67, 72.80, 61.85, 54.82, 49.22, 48.65, 45.53, 42.93, 42.49, 38.77, 35.59, 35.24, 34.94, 31.32, 30.88, 29.68, 28.16, 26.50, 25.90, 25.72, 24.88, 21.46, 21.30, 18.34, 13.03, 12.10; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3070。

(4)6-α-乙基-7-酮-石胆酸甲酯(D)的合成

称取中间体75.00 g(0.012 mmol)溶解于140 mL甲醇中，完全溶解后，缓慢滴加3 mL浓硫酸至反应液,室温下反应1 h(TLC检测)。反应完全后蒸干溶剂，残余物加二氯甲烷溶解，用水(3×200 mL)洗涤，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)纯化得白色泡沫状固体D2.95 g，收率33%，HPLC纯度96.0%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 3.67～3.63(m, 3H), 3.52(m, 1H), 2.68(m, 1H), 2.41～2.27(m, 2H), 2.26～2.10(m, 2H), 2.01～1.87(m, 2H), 1.86～1.58(m, 10H), 1.51～1.27(m, 6H), 1.20(s, 6H), 1.17～1.04(m, 4H), 0.89(m, 5H), 0.80(m, 4H), 0.64(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ:212.72, 174.66, 71.15, 54.76, 51.98, 51.45, 50.66, 49.91, 48.96, 43.67, 42.63, 38.97, 35.66, 35.18, 34.24, 31.78, 31.02, 30.97, 29.85, 28.26, 24.59, 23.48, 21.84, 18.80, 18.33, 12.03, 11.95; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C27H44O4Na {[M+Na]+}455.3132, found 455.3145。

(5)3-α-乙酰基-6-α-乙基-7-酮-石胆酸(E)的合成

依次称取中间体7100 mg(0.239 mol), NaHCO30.4 g(0.005 mol)，乙酸酐0.4 mL(0.004 mol)，溶解于4 mL 四氢呋喃中，65 ℃下回流搅拌12 h(TLC检测)。反应完全后蒸干溶剂，残余物加二氯甲烷溶解，再滴加1 mol/L HCl溶液调节pH为5，用水(3×200 mL)洗涤，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯=10/1,V/V)纯化得白色固体E34 mg，收率31%，HPLC纯度98.6%;1H NMR(300 MHz, CDCl3)δ: 8.51(s, 1H), 4.60(m, 1H), 2.67(q,J=6.3 Hz, 1H), 2.33(t,J=11.1 Hz, 2H), 2.17(m, 2H), 1.96(s, 5H), 1.89～1.55(m, 8H), 1.55～1.00(m, 16H), 0.98～0.70(m, 9H), 0.62(s, 3H);13C NMR(75 MHz, CDCl3)δ: 212.58, 180.00, 170.60, 73.18, 54.72, 51.90, 50.41, 49.82, 48.84, 43.58, 42.54, 38.84, 35.58, 35.10, 33.77, 31.26, 30.79, 28.17, 27.63, 25.87, 24.48, 23.39, 21.78, 21.23, 18.72, 18.25, 11.98, 11.93; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C28H44O5Na {[M+Na]+}483.3081, found 483.3073。

2 结果与讨论

2.1 构型的确定

为了确定6-乙基立体构型，对杂质A(图1)和中间体7(图2)的1H NMR进行了解析，两个化合物8-H的化学位移由于受到化合物的立体结构的影响，分别为δ2.47的三重峰以及δ2.68的四重峰。通过比较两个化合物的立体结构，中间体7的α型的乙基与羰基氧离得更近，易与羰基形成氢键，使8-H的化学位移向低场偏移。同时成功得到杂质A的单晶结构，进一步确定了化合物结构(图3)，通过晶体结构可以看出，其6-乙基(C12和C13)为β构型。得到的5个杂质用HPLC进行含量测定，并且在该HPLC条件下，5个杂质能有效分离。

δ

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图3 A的单晶衍射图谱

2.2 碱的影响

实验过程中，发现通过控制碱的浓度可获得具有不同构型的6-取代的化合物，在使用10 M 氢氧化钠时，可以以100%的收率得到单一化合物7；在1 M NaOH 的条件下，可以获得两种构型的6-取代的化合物(A/7=89/11)。

以易得的化合物5为原料，经过简单的操作，合成了5个奥贝胆酸关键中间体杂质。并通过HPLC确定了所有杂质纯度均在96%以上，为奥贝胆酸生产工艺的研究和质量研究提供了更简单的杂质制备策略。