瑞舒伐他汀对载脂蛋白E基因敲除动脉粥样硬化小鼠的作用研究

吴 妍 韩 铨 胡 柳 王昱植 付国峰 郭 璐

浙江养生堂天然药物研究所有限公司，浙江杭州 310024

动脉粥样硬化属于心脑血管疾病范畴，涵盖冠心病的根本病理基础，是冠心病的主要潜在病因，包括脂质代谢失调以及涉及单核细胞与功能紊乱的内皮细胞结合[1]。动脉粥样硬化的发生发展是一个长期且十分复杂的病理过程，近几十年来，已有多种假说解释动脉粥样硬化的发病机制，包括氧化应激学说、机械损伤学说、炎症学说等[1]，但目前为止以上所有学说均不能很好全面地解释动脉粥样硬化发生与发展的全过程。由于动脉粥样硬化发病机制的复杂性以及其具有动态变化的特性，给动脉粥样硬化的治疗带来了一定的困难。近年来，中医中药的疗效优势逐渐受到重视，但中药复方的作用靶点仍不甚明了。目前他汀类药物是临床应用最为广泛的调脂药物[2]。本研究在既往研究的基础上，以载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE-/-）基因敲除动脉粥样硬化小鼠为研究对象，观察瑞舒伐他汀调控血脂及相关炎症指标和抗动脉粥样硬化斑块形成的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 ApoE-/-小鼠，6 周龄，共20 只。同龄的具有相同遗传背景的C57BL/6/J 小鼠10 只。所有动物均在浙江省医学科学院实验动物中心饲养，SPF 级，自由饮水及摄食。实验动物购自南京集萃药康生物有限公司，合格证号：SCXK（苏）20180008。本实验已经过相关动物伦理委员会审核同意。

1.1.2 药物及试剂 瑞舒伐他汀片[商品名：可定；规格：10 mg/片（按照人体最大剂量换算）；批号：S01102；阿斯利康药业（中国）有限公司]。苏丹Ⅳ染色剂（Sigma，货号：198102）、无水乙醇、二甲苯购自中国医药集团上海化学试剂公司。

1.1.3 仪器 LWC400 全自动血生化分析仪（深圳蓝韵医疗科技有限公司）；OLYMPUS-SZ61 体式显微镜（Olympus optical 公司）；Kylin-bell TS-2 数显摇床；西门子Sequoia512 彩色多普勒超声诊断仪。

1.2 分组、造模及给药

所有ApoE-/-小鼠6 周龄起全程给予高脂饲料。20 只ApoE-/-小鼠随机分为模型组和瑞舒伐他汀组，每组各10 只。另10 只C57BL/6J 小鼠作为正常组予以普通饲料。正常组：给予等体积水灌胃并同时给予普通饲料；模型组：给予等体积水灌胃并同时给予高脂饲料；瑞舒伐他汀组：按瑞舒伐他汀片10 mg/kg剂量灌胃给药并同时给予高脂饲料。所有小鼠均于16 周龄起给予药物或水灌胃，灌胃时间为每天上午10 点，每天灌胃1 次，共计4 周，给药并观察至20 周龄末取材。

1.3 取材

每组小鼠于20 周龄末摘眼球取血并分离血清，检测总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细胞间黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。分离主动脉予以甲醛固定，一半进行动脉粥样硬化斑块染色，一半进行斑块稳定性及血管硬化程度分析。

1.4 检测指标

1.4.1 血脂检测 各组小鼠分别摘眼球，内眦取血，离心分离血清，检测TC、TG、LDL。

1.4.2 血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 变化检测 按照试剂盒说明书进行检测。

1.4.3 主动脉病理形态学观察 取主动脉，甲醛固定，并采用苏丹Ⅳ染色剂进行染色，使用Image J 进行斑块面积分析。

1.4.4 动脉超声检测 所有小鼠在处死之前1 d 禁食超过8 h，检查前剔除腹部体毛，应用西门子Sequoia512彩色多普勒超声诊断仪，14 MHz 高频线阵探头分别测量肝后段主动脉中膜厚度3 次，取平均值。同时测量同一位置主动脉最大血流速度3 次（θ 角=60°），取平均值。

1.4.5 动脉粥样硬化斑块稳定性分析 使用Movat5 色套染法和HE 染色，利用图像分析软件测量并计算胞外脂质、泡沫细胞、胶原以及平滑肌各自占斑块面积的比例，根据计算公式：斑块易损指数=（胞外脂质成分+泡沫细胞）/（平滑肌细胞+胶原成分）综合评估瑞舒伐他汀对小鼠主动脉斑块稳定性的影响。

1.4.6 动脉粥样硬化血管硬化程度分析 取小鼠主动脉弓血管，包埋、切片后使用Von Kossa 染色法，在光镜下观测主动脉钙盐沉积情况。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瑞舒伐他汀对小鼠血脂水平的影响

与正常组比较，模型组小鼠的血清TC、TG、LDL水平均升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，瑞舒伐他汀组小鼠的血清TG 水平下降，差异有统计学意义（P<0.01）；瑞舒伐他汀组小鼠的血清LDL、TC 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图1）。

2.2 瑞舒伐他汀对小鼠炎症指标的影响

与正常组比较，模型组小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平均升高，差异有统计学意义（P<0.01）；瑞舒伐他汀组小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。

图2 各组实验小鼠血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平的比较（mmol/L，±s，n=10）

2.3 瑞舒伐他汀对斑块面积的影响

模型组小鼠的主动脉斑块沉积面积平均值达39.66%，瑞舒伐他汀组小鼠的主动脉斑块沉积面积平均值达25.87%；瑞舒伐他汀组与模型组小鼠的主动脉斑块沉积面积比较，差异有统计学意义（P<0.01）（图3，封三）。

图3 瑞舒伐他汀对斑块面积的影响（n=6）

2.4 瑞舒伐他汀对主动脉中膜厚度的影响

主动脉超声结果显示，各组小鼠的主动脉中膜厚度比较，差异无统计学意义（F=0.8965，P=0.4302）（图4）。

图4 各组实验小鼠主动脉中膜厚度的比较（±s，n=5）

2.5 瑞舒伐他汀对斑块稳定性的影响

与模型组比较，瑞舒伐他汀组的斑块易损指数降低，差异有统计学意义（P<0.01）（图5，封三）。

图5 瑞舒伐他汀对斑块稳定性的影响（n=5）

2.6 瑞舒伐他汀对血管钙化程度的影响

与模型组比较，瑞舒伐他汀组的血管钙化面积降低，差异有统计学意义（P<0.01）（图6，封三）。

3 讨论

动脉粥样硬化是冠心病的主要潜在病因，是脂质代谢失调以及涉及单核细胞与功能紊乱的内皮细胞结合，包括其募集到动脉壁易感区以及分化为巨噬细胞并发育成泡沫细胞的炎症过程的综合结果[1，3]。泡沫细胞的积累使动脉内膜出现脂肪条纹，进而随着疾病的发展，泡沫细胞逐渐积累，导致形成动脉粥样硬化斑块[1，4]。他汀类药物是临床验证有效的胆固醇合成抑制剂。他汀类药物在降低血脂以及冠心病的一、二级预防中的作用已在多项大规模临床试验一致地被证实[2]。然而，相关研究表明，他汀类药物的作用可能远不止其降低血脂水平的作用[5-6]。他汀类药物可能通过与血脂降低依赖无关的机制防止动脉粥样硬化来保护心血管系统。瑞舒伐他汀已显示出几项有益的特征，包括半衰期长、安全性良好以及较低可能与细胞色素P450 发生药物相互作用等[7]。本研究利用ApoE-/-小鼠，探索瑞舒伐他汀在动脉粥样硬化形成后的作用效果以及在斑块稳定性和血管钙化方向的改善情况。

引起动脉粥样硬化过程最广泛使用的动物模型是ApoE-/-小鼠[8]。ApoE-/-小鼠在正常的饮食条件下会发展为明显的高胆固醇血症，到3 个月大时会在主动脉窦和主动脉近端形成富含泡沫细胞的脂肪病变[9-10]，并在8～9 个月后出现纤维性病变[9，11-12]。这些小鼠的动脉粥样硬化病变具有人类和其他物种所特有的特征[9，11，13]，它们含有氧化特异性表位[14]，并且黏附分子VCAM-1 和ICAM-1 以及TF 的表达在该小鼠品系中被上调[15-16]。ApoE-/-小鼠对类似人的西方饮食（富含胆固醇）和药理治疗敏感[17-18]。

本研究发现瑞舒伐他汀在高胆固醇血症ApoE-/-小鼠中具有抗动脉粥样硬化的特性，除了降低血清TG 外，并没有降低胆固醇和降低炎症的作用。实际上，在实验条件下，瑞舒伐他汀治疗既不影响血浆脂质（TC），也不影响治疗期间胆固醇的总体暴露。Sparrow 等[19]也观察到类似的结果。据报道，他汀类药物在降低野生型和ApoE-/-小鼠的胆固醇水平方面均无效，这可能是由于缺乏LDL 受体（ApoE 的配体之一），或由于在该种小鼠体内发生的HMG-CoA 还原酶补体代偿性增加所致[19-21]。瑞舒伐他汀不具有很强的降胆固醇活性，这使得能够评估其抗炎和抗血栓形成作用，并独立于药物的降胆固醇特性来考虑它们。在ApoE-/-小鼠内皮中易发生动脉粥样硬化的部位，VCAM-1 和ICAM-1 的表达会上调，这一数据与相关报道[15]的研究结果一致。Kleeman 等[22]研究表明，瑞舒伐他汀可以降低血管壁中促动脉粥样硬化性细胞因子（如MCP-1 和TNF-α）的表达。但在本项研究中并未得到相似结果。

血管内膜-中膜厚度是指内膜回声至中膜-外膜回声之间的垂直距离，超声测试模式测量动物血管厚度大大提高了测量血管厚度的方便性和准确性，而这一技术也在各种研究中逐渐普及[23]。本研究结果显示，瑞舒伐他汀组的斑块易损指数低于模型组（P<0.01），并且可以评估不同主动脉段的斑块稳定性情况。血管钙化是指发生于血管软组织内的不适当的钙化，是动脉粥样硬化后期的病理表现，表现为血管壁僵硬性增加，顺应性降低，易引发血栓形成，斑块破裂，是心脑血管疾病高发病率和高死亡率的重要原因。本研究发现ApoE-/-模型组小鼠主动脉弓部位的血管有较多的钙盐沉积，即血管发生较为严重的硬化，瑞舒伐他汀组未有钙盐沉积。并且可以考虑不同主动脉段的血管硬化情况。

综上所述，瑞舒伐他汀可通过非降脂途径降低ApoE-/-小鼠的动脉粥样硬化程度，并可改善斑块的易损性以及血管钙化程度。