黑龙江省柳属种质的生长与药用性状评价

闫嵩 任伟超 徐姣 刘美琦 于欣欣 王思嘉 马伟

摘要：通过对柳属植物种质资源品质特征的探究，对其进行初步的鉴定与评价。柳属种质资源评价模型基于生长和药用性状进行构建。其中杞柳、筐柳、谷柳的总黄酮含量较高，杞柳含量达0.225 6 mg/g;筐柳、金丝垂柳、松江柳的原花青素含量较高，筐柳含量达0.156 8 mg/g;五蕊柳、筐柳、细叶沼柳的木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量较高，五蕊柳含量达2.130 7 mg/g。以构建的科学评价方法，筛选出6种具有良好利用价值的优良种质资源，分别为旱垂柳、五蕊柳、金丝垂柳、筐柳、旱柳和垂柳。为实现各指标的量化性和直观性，本研究构建了科学的评价方法，为柳属育种筛选、传统育种及分子育种研究提供种质资源，为柳属植物药用成分开发利用提供了一定的理论依据。

关键词：柳属;生长性状;药用性状;种质资源;综合评价

中图分类号： S792.120.1  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）17-0128-06

收稿日期：2021-01-05

基金项目：国家中医药管理局全国中药资源普查项目（编号：GZY-KJS-2018-004）;黑龙江中医药大学优秀创新人才领军人才项目（编号：2018RCL09）。

作者简介：闫 嵩（1989—），男，黑龙江哈尔滨人，博士，主要从事中药资源研究。E-mail：394576931@qq.com。

通信作者：马 伟，博士，研究员，主要研究方向为药用植物生物工程。E-mail：mawei@hljucm.net。

柳属（Salix）是杨柳科（Salicaceae）中最大的一个属。柳属种类繁多，有520多种，主产于北半球温带地区，少量分布在南美洲和非洲的南部[1-3]。柳属植物的树皮中含有单宁，可供工业应用或药用，嫩枝叶可作动物饲料，同时也是早春蜜源植物[4]。在生态方面，柳属植物因具有发达的根系可有效保持水土、防风固沙。柳属植物由于含有多种药效活性化学成分而具有广泛的药理作用[5-11]。柳属的叶、皮、花序等部位的提取物在抗血栓、降血压、抗应激、促进免疫力、抗炎、止痛、利尿、凝血、抗肿瘤等方面具有良好的临床效果[12]。

目前，关于柳属植物的资源评价主要围绕光能利用效率评价[13]、抗盐碱性评价[14]、观赏性评价以及用材价值评价[15]等，缺少关于柳属植物的药用价值的评价，忽略了柳属的部分经济价值，未能合理全面地利用柳属植物价值。因此，对资源丰富、原料易得的柳属植物建立以药用成分为评价指标的评价体系，将有助于柳属植物种质资源评价及利用，筛选出具有活性强、疗效高、毒副作用小的天然藥用成分，对柳属的药用植物开发与利用具有重要意义。本研究以采自黑龙江省的26种柳属种质资源为材料，采用层次分析法，基于生长性状和药用性状对柳属综合性状进行分析与测定，并建立不同权重的决策指数综合评价法。

1 仪器与材料

HH4型数显恒温水浴锅（上海邦西仪器科技有限责任公司），BMB 224型电子分析天平（苏州坤宏电子有限公司），UV-1601 PC型紫外-可见分光光度计（SHIMADZU日本岛津），Waters 2695-2996型高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2998型紫外检测仪器（美国Waters公司）。

芸香苷标准品、原花青素标准品（中国食品药品检定研究院），木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷标准品（四川维克奇生物科技有限公司），亚硝酸钠，氢氧化钠，硝酸铝，无水乙醇，冰醋酸，浓盐酸，香草醛、石油醚（60～90 ℃）均为分析纯，甲醇（分析纯、色谱纯）（哈尔滨沃森实验用品经销部）。

试验用柳属植物叶片采自黑龙江省森林植物园、小兴安岭植物园、大兴安岭塔河地区，经形态学鉴定，具体柳属原料来源见表1。

2 试验方法

2.1 供试品溶液制备

取供试品粉碎，过40目筛，精密称取2.00 g。

称量100 mL石油醚（60～90 ℃）倒入索式提取器，恒温水浴锅90 ℃加热，回流提取1.5 h;弃去石油醚，烧瓶中加入100 mL甲醇/50%乙醇，再加热 60 ℃，回流提取4 h，过滤，将甲醇滤液抽滤，定容至50 mL，取2 mL溶液，再用10 mL容量瓶定容。经有机系微孔滤膜（直径为0.45 μm）过滤后，将样品置于4 ℃冰箱保存备用。

2.2 对照品溶液的配制

称取芸香苷对照品109.80 mg，加50%乙醇溶解后，置于100 mL容量瓶中定容，制成浓度为1.098 0 mg/mL的芸香苷标准溶液;称取原花青素对照品20.54 mg，加50%乙醇溶解后，用50 mL容量瓶定容，配制成浓度为0.410 8 mg/mL的对照品溶液;称取木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品20.00 mg，加入甲醇，用100 mL容量瓶定容，取 4 mL 至20 mL容量瓶稀释至刻度，摇匀制得对照品溶液。以上溶液均用锡纸包裹后，在4 ℃冰箱中遮光保存。

2.3 紫外-可见分光光度法

取芸香苷对照品溶液2.5 mL和待测样品溶液1 mL，分别置于25 mL具塞试管中补充溶液至 10 mL，分别加入显色剂，定容至25 mL静置 20 min。将对照品溶液和待测样品溶液在430～700 nm 波长内进行扫描，选取两者最大吸收值对应的波长作为芸香苷的最大吸收波长。

取原花青素对照品溶液和待测样品溶液各 1 mL，分别置于10 mL具塞试管中，分别依次加入显色剂，摇匀后用甲醇定容至10 mL，室温条件下遮光反应20 min。以甲醇作为空白参比，设置波长 400～700 nm，将对照品溶液和待测样品溶液进行扫描，选取两者共同最大吸收值的波长为原花青素的最大吸收波长。

2.4 高效液相色谱法

本研究利用高效液相色谱法测定柳属中木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分的含量，确定色谱条件[16]：色谱柱Syncronis C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）、醋酸水（醋酸与水的体积比为1 ∶100）（B），体积流量1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μL，检测波长为254 nm。线性洗脱程序：15% A （0～20 min）;100% A （20.01～40 min）。流动相比例的选择：流动相15%～30% A（0～5 min），30%～50% A（5～8 min），50%～52% A（8～16 min），52%～54%A（16～20 min）。

2.5 稳定性试验

取待测样品1.0 mL于试管中，每2 h测定待测品溶液总黄酮和原花青素的吸光度（D），连续测定12 h，稳定性试验结果通过统计可知，二者相对标准偏差（RSD）分别为0.82%、1.08%。证明样品溶液在12 h内基本稳定。高效液相色谱仪测定待测样品，分别放置5、10、24、35、48 h进样，测量木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷吸收峰面积，RSD为0.85%，说明提取物中木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的稳定性良好。

2.6 精密度试验

2.6.1 考察紫外-可见分光光度计的精密度 连续6次测定样品的吸光度，发现6次测量结果RSD为0.68%，证明该仪器的精密度良好。

2.6.2 考察高效液相色谱的精密度 连续6次测定样品的峰面积，发现6次测量结果RSD为1.46%，说明该仪器的精密度良好。

2.7 加样回收率试验

取同一待测样品1.0 mL共3份，每份加入芸香苷、原花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品1.098、0.410 8、1.0 mL，然后进样测定，计算回收率，3份样品的回收率分别为96%～104%、97%～103%、95%～105%，RSD分别为2.48%、1.87%、2.24%。

2.8 考察线性关系

精密量取芸香苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于具塞试管中，补充溶液至 10 mL，加入显色剂静置后，用50%乙醇水溶液定容至 25 mL，再静置20 min，以50%乙醇水溶液为空白参比。在507 nm处测定各浓度对照品吸光度。取原花青素对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加入显色剂，用甲醇定容至10 mL，遮光反应20 min，以50%乙醇水溶液为空白参比，在497 nm处测定不同浓度标准品吸光度。木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进样量分别为2、5、10、15、20、25、30、35 μL，以甲醇为空白参比。因此，得到的标准曲线方程和回归方程分别为

Y1=14.196 0X1+0.012 6，r1=0.999 2;

Y2=10.668 0X2-0.010 1，r2=0.998 7;

Y3=4.0×100.6X3+506.2，r3=0.999 8。

其中，X1、X2、X3分別为芸香苷、花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量浓度;Y1、Y2为吸光度;Y3为峰面积。

3 结果与分析

3.1 柳属生长性状指标测定结果

在柳属种质资源调查过程中，用卷尺和胸径尺测量胸径（地面上1.3 m处）;用卷尺测量冠幅的东西、南北2个方向直径，取2个方向的平均值;用测高测距仪测量树高。具体测量的柳属植物树高、胸径、冠幅和分枝数的生长性状指标见表2，用于后续柳属资源评价细节评分。

3.2 柳属植物资源评价体系层次模型的判断矩阵和权重

按照层次分析法对层次隶属关系及指标关联性要求，建立柳属资源综合评价模型[17-20]。模型分为3层，第1层为目标层（A），第2层为准则层（B），

第3层为因子层（C）。采用德尔菲法进行指标权重的确定。给20位专家发函，内容包括评价权重调查表和具体指标性状评分表，专家对7项指标进行赋分，采用4分制进行打分，打分标准见表3。

收回专家问卷并进行数据统计。将数据输入Yaahp 6.0，进行两两因素相对重要性比对，采用四舍五入取整法构建判断矩阵，公式如下。

Wi=1n∑nj=1aij∑nk=1akj，i=1，2，…，n。

式中：Wi为第i项指标的权重;aij为i指标比j指标的重要性等级;akj为k指标比j指标的重要性等级;n为指标总数。

最终确定各准则层、因子层的权重值大小。其中生长指标和药用指标准则层中，药用性状占主要部分，其权重为0.666 7，生长性状次之，为0.333 3。综合柳属植物资源评价体系指标权重分配情况，建立了柳属植物资源评价体系，见表4。

3.3 总黄酮、原花青素、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量

分别利用紫外-可见分光光度计和高效液相色谱仪测试柳属叶片中总黄酮含量、原花青素含量、木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（木樨草苷）的含量（表5）。由表5可知，杞柳总黄酮含量最高，为0.225 6 mg/g;筐柳较高，为0.152 2 mg/g;含量居中（0.08～0.15 mg/g）的依次是谷柳、卷边柳、蒿柳、越桔柳、毛枝柳、乌柳，其余的含量较低（<0.80 mg/g），含量最低的为三蕊柳（0.038 5 mg/g）。由表5可知，原花青素含量较高（≥0.10 mg/g）的是筐柳（0.156 8 mg/g）;含量居中（0.06～0.10 mg/g）的依次是金丝垂柳、松江柳、朝鲜柳、杞柳、卷边柳、毛枝柳、兴安柳;其余的含量较低（<0.06 mg/g），含量最低的为垂柳（0.012 5 mg/g）。由表5可知，通过对26种柳属植物叶片提取物进行检测，发现大多数柳树中都含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，然而深山柳、粉枝柳、朝鲜柳、蒿柳、卷边柳、兴安柳和越桔柳等7种柳属植物在14.7 min处没有出峰（图1），因此判断这7种柳属中不含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷成分。各种柳属木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量较高的（>1.00 mg/g）有五蕊柳、筐柳、细叶沼柳;含量中等（0.40～1.00 mg/g）有乌柳、沼柳、杞柳、松江柳、龙江柳;其余柳树含量较低（<0.40 mg/g）。

3.4 柳属种质资源综合评价和排序及优质柳属的筛选

Y=∑Wiyi。

式中：Y为综合评价得分;Wi为第i项指标的权重值;yi为第i项指标得分。

按上式计算柳属各种质资源价值综合得分。在各项评分的基础上进行计算，求得各自综合评价值。由表6可知， 综合评价得分排序结果从高到低分别为旱垂柳、五蕊柳、筐柳、金丝垂柳、旱柳、垂柳、龙爪柳、朝鲜柳、卷边柳、谷柳、三蕊柳、细叶沼柳、杞柳、大黄柳、龙江柳、松江柳、圆头柳、毛枝柳、乌柳、细柱柳、沼柳、粉枝柳、蒿柳、深山柳、兴安柳、越桔柳。

4 结论与讨论

本研究以26种柳属柳树为研究对象，采用层次分析法对柳属种质资源进行评价，构建了柳属种质资源评价模型，设立了2个准则层指标，包括生长指标和药用指标。设计专家调查问卷，建立判断矩阵并计算各因子层指标的权重。结合柳属叶片药用化学成分含量的紫外-可见分光光度计和高效液相色谱仪的检测结果，获得对资源价值定性和定量的综合判断分数。

首次以药用化学成分含量作为柳属资源评价的二级指标，采用紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法测试柳属中总黄酮、原花青素和木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。26种柳属柳树中总黄酮含量较高的为杞柳、筐柳、谷柳等。原花青素含量较高的为筐柳、金丝垂柳、松江柳等。除了深山柳、粉枝柳、朝鲜柳等8种柳属植物以外，其他均含有木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，含量较高的为五蕊柳、筐柳、细叶沼柳等。据此推断，不同地域生长的同物种，木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量不同，如哈尔滨的筐柳（40.67 mg/mL）比伊春的筐柳（30.91 mg/mL）含量高，可能是因为生长环境不同，木樨草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的累积量不同，也与树龄有关。

基于层次分析法，将柳属资源进行综合评价及排序，从生长性状和药用价值方面对柳属资源进行了科学评价，筛选出旱垂柳、五蕊柳、金丝垂柳、筐柳、旱柳和垂柳6种具有良好利用价值的优良种质资源，可作为遗传育种方面研究的优势种质，同时也为柳属药用资源开发利用提供了理论依据。

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