四川豌豆种质资源白粉病抗性及分子鉴定

项超孙素丽朱振东宗绪晓杨涛刘荣杨梅鲜东锋杨秀燕

（1四川省农业科学院作物研究所，610066，四川成都；2中国农业科学院作物科学研究所，100081，北京）

豌豆（Pisum sativum L.；2n=2x=14）是世界第四大食用豆类作物，在全世界广泛栽培，中国是世界三大豌豆主产国之一[1]。豌豆生育过程中受多种病虫害影响，由气传性白粉菌（Erysiphe pisi D.C.）侵染导致的白粉病是豌豆最重要的病害之一。豌豆白粉病主要发生在温带及亚热带地区，在白天温暖、夜间冷凉的气候条件下最易发病，豌豆感病后产量一般降低25%～50%[2-3]，感病严重时产量损失可达85%以上[4]。在中国，大部分豌豆种植区均有白粉病发生，其中云南、四川、甘肃、贵州和福建等省份危害严重，部分地区豌豆感病品种病情指数可达100%[5]。因此，如何有效地控制白粉病发生和危害是我国豌豆生产面临的严峻考验。

豌豆是最早被驯化的作物之一，但在品种白粉病抗性的遗传改良上相对其他作物较为落后。迄今为止，仅在豌豆种质中鉴定出2个隐性抗白粉病基因er1[6]和er2[7]，且鉴定出唯一1个显性抗白粉病基因Er3来源于豌豆野生种Pisum fulvum[3]。3个抗病基因介导的抗性反应有所不同，其中er1可以抵抗白粉菌侵入表皮细胞，表现为免疫或高抗，叶片上肉眼几乎看不到坏死斑；er2和Er3能阻止已入侵病原菌在组织中的进一步扩展（产生过敏性反应），er2抗性表现受温度和叶龄等条件的影响，而Er3则不受温度影响[8-9]。

近年来，Ondřej等[10]和Attanayake等[11]已分别证明鲍勒白粉病菌（E.baeumleri）和车轴草白粉病菌（E.trifolii）均可以克服er1介导的抗性，同时Fondevilla等[12]还确定了车轴草白粉病菌可以克服Er3介导的抗性，且有研究表明在部分国家和地区er1和er2介导的抗性已经丧失[13-14]，因此急需寻找到新的抗病材料及抗病基因，以预防新的致病病原菌流行时仅含有上述抗病基因的品种发生大规模白粉病病害而引起巨大的产量损失。

我国豌豆生产中抗白粉病的优异豌豆品种较少，鉴定抗性资源、筛选及培育抗性品种是解决白粉病危害的有效途径[15-16]。本研究旨在对四川豌豆地方种质资源进行白粉病抗性及分子鉴定，以期筛选出抗白粉病资源，鉴定出抗白粉病分子标记基因型，为四川豌豆抗白粉病研究及育种提供抗源材料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

400份豌豆种质资源均为四川省农业科学院豆类种质资源库保存，其中24份为国外引进资源，376份为国内资源（附表）。国内资源中，四川省78个县（市、区）303份，重庆51份、青海6份、北京4份、陕西3份、新疆3份、安徽3份、甘肃1份、广东1份、浙江1份。对照为感病品种成豌8号。

1.2 温室白粉病侵染型鉴定

400份豌豆种质资源各取5粒分别播种于含营养土的250mL纸杯中，在18℃～26℃的温室内培养，当幼苗第3、4茎节复叶展开时，将分生孢子抖落在幼苗植株上接种白粉菌（采自甘肃省定西地区的豌豆白粉病菌分离物，经在豌豆品种坝豌6号上扩繁后用于接种），后置于18℃～22℃温室培养。感病对照品种接种完全发病后（约10d），调查各供试资源病害侵染型（infection type，IT，0～4型），抗性评价标准以 0型为免疫（I），1～2型为抗病（R），3～4 型为感病（S）[5]。

1.3 豌豆基因组DNA提取与分子标记分析

每份资源取3株豌豆的幼嫩叶片等量混合，用植物基因组DNA提取试剂盒（DN32，济宁谷熙生物科技有限公司）提取供试材料基因组DNA。用7个与已知抗病（或感病）基因连锁的SCAR标记对400份豌豆资源进行分子鉴定，标记的详细信息见表 1。PCR 反应体系为 20μL：含 0.8μL（20ng/μL）基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、10μL2×T5 super Mix（北京擎科新业生物技术有限公司）和8.2μL ddH2O。PCR扩增程序为98℃预变性3min；98℃变性10s，退火10s，72℃延伸10s，循环40次；72℃延伸5min。采用300V恒压、2% TBE琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

表1 用于豌豆资源标记基因型鉴定的分子标记Table 1 Molecular markers for genotyping pea germplasms

1.4 数据统计与分析

采用Excel对数据进行统计；采用NTSYS-PC 2.1软件的SAHN程序和欧式遗传距离按非加权配对算术平均法（UPGMA）计算各豌豆品种间的欧式遗传距离，并以此进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 豌豆种质资源白粉病抗性统计及其地理分布

接种豌豆白粉菌10d后，当对照感病品种完全发病且叶片产生大量分生孢子，病害侵染型为4型时（图1），统计400份参试资源对白粉病菌分离物的抗性反应。有8份（2.00%）资源表现免疫，分别是犍为大绿、金堂黄麻-2、SV 51741、大邑白豌豆、青Q88、青Q79、青Q72-1和青Q72-2；3份（0.75%）表现为抗病，分别是会理大菜豌、高县大麻-2和Ji 1194；5份（1.25%）表现为抗感分离，分别是会理大白、会理大白壳、昭化麻-1、绵阳花和眉山菜；其余384份（96.00%）均为感病。在24份国外资源中，有6份表现为免疫或抗病，分别占国外资源总数和抗性资源的25%和37.5%，这些资源来自于加拿大、英国和瑞典。303份四川资源中有10份表现免疫或抗病，占四川资源总数的3.3%，主要分布（表2）在四川省中部不同纬度地区，其中3份免疫的资源分别来自犍为县、金堂县和大邑县，2份抗病的资源来自高县和会理县，5份表现为抗感分离的资源来自会理县、广元市昭化区、绵阳市和眉山市。

图1 抗病、免疫和感病植株对比Fig.1 Comparison of resistant,immune and susceptible plants

表2 四川抗性资源分布Table 2 Sichuan resistant resources distribution

2.2 豌豆资源基因型鉴定

用与豌豆抗白粉病er1（Er1）、er2和Er3基因连锁的7个SCAR标记ScOPD-10650、ScOPE-161600、ScOPO-181200、ScOPX-04880、ScX17_1400、SCW4637和SCAB1874对400份种质资源进行基因型鉴定。图2为7个标记在部分豌豆品种（系）中的扩增结果。在400份种质资源中，与抗病基因er1连锁的标记ScOPD-10650和ScOPE-161600分别在365份（91.25%）和334份（83.50%）资源中扩增出条带，与感病基因Er1连锁的标记ScOPO-181200、ScOPX-04880分别在350份（87.50%）和367份（91.75%）资源中扩增出条带，与抗病基因er2连锁的标记ScX17_1400在359份（89.75%）资源中扩增出条带，与抗病基因Er3连锁的标记SCW4637和 SCAB1874分别在 88份（22.00%）和 394份（98.50%）资源中扩增出条带（表3）。

表3 7个分子标记扩增条带资源份数Table 3 Number of accessions with amplified fragment of seven molecular markers

图2 7个与白粉病抗性基因连锁的SCAR标记扩增条带Fig.2 Fragments amplified by seven SCAR markers linked to the powdery mildew resistant genes

感病对照品种成豌8号中，ScOPE-161600没能扩增出目标条带，其他6个分子标记均能扩增出目标条带。在16份表现出抗性的资源中，ScOPD-10650和SCAB1874在所有表现出抗性的资源中均有扩增，ScOPX-04880仅在犍为大绿中未扩增出目标条带，ScOPE-161600仅在青Q79和青Q72-2中未扩增出目标条带，ScOPO-181200、ScX17_1400和SCW4637分别在11份、13份和9份免疫或抗病资源中有扩增条带。

400份种质资源由7个分子标记区分为39个标记基因型，16份表现出抗性的种质资源分为7个标记基因型（图3）。标记基因型G4包含资源数量最多，占比46%，其中包括抗性资源眉山菜、绵阳花、高县大麻-2、会理大菜豌和会理大白。昭化麻-1和金堂黄麻-2属于相同标记基因型（G14），青Q88、Ji1194、Sv51741和青Q72-1属于相同标记基因型（G16），青Q72-2（G17）、会理大白壳（G18）和大邑白豌豆（G33）分别属于3个不同标记基因型，犍为大绿（G21）和青Q79（G30）分别单独组成一个标记基因型。

图3 400份豌豆种质资源抗白粉病标记基因型鉴定聚类分析Fig.3 Cluster analysis of molecular marker genotyping of 400 pea germplasms resistance to powdery mildew

3 讨论

随着世界豌豆产业受白粉病危害越来越严重，主产国对白粉病基础和应用研究更为重视，重点开展了种质资源的抗性鉴定、抗性基因挖掘、高密度构建遗传图谱和基因组等研究工作，培育豌豆抗病品种应对白粉病危害在主产国效果显著[4,15,22-23]。豌豆在我国属于小杂粮作物，其基础研究较为薄弱，抗白粉病资源筛选与分子鉴定的研究不多。20世纪90年代，彭化贤等[24]在四川省攀枝花市和西昌市白粉病重病区对国内外811份豌豆资源采用田间人工接种诱发法进行抗白粉病鉴定，没有发现抗性资源。2009-2011年，曾亮等[25]对国内外535份豌豆材料开展连续3年白粉病抗性田间鉴定，对表现出抗性的20个材料进行室内苗期接种鉴定，最终仅筛选出1份高抗、2份抗病和13份中抗材料。2012-2013年，陆建英等[26]对国内外收集的436份豌豆资源进行田间鉴定，筛选出主要来自于我国云南、甘肃和青海省的35份抗病材料。王仲怡等[27]采用北京和云南白粉菌分离物对396份国内外豌豆资源在温室进行接种鉴定，筛选出46份双免疫资源，仅8份双免疫资源来源于中国云南。从上述研究可以看出，抗性材料所占比例非常低，且国内抗性资源更少。本研究对400份豌豆种质资源在温室进行白粉病抗性鉴定，筛选出16份抗白粉病资源，其中10份抗白粉病资源为四川地方品系，主要分布在四川省中部的不同纬度地区，且有4份资源对白粉病免疫，这将为四川豌豆抗白粉病育种提供有效抗源。

开发有效的分子标记有利于准确鉴定抗白粉病基因。王仲怡等[27]和付海宁等[28]均利用4个与er1连锁的分子标记对豌豆抗性资源进行分子鉴定并区分标记基因型，发现感病品种与部分抗性品种（系）的扩增条带和标记基因型相同，表明目前开发的分子标记不能有效鉴定er1基因。Tiwari等[18]利用与er1连锁的分子标记PD10650鉴定15个加拿大豌豆品种（含4个感病品种）时，发现除品种JI 1758外均能扩增出大小相似的片段，且没有检测出扩增片段序列的差异。前人研究表明，开发的连锁SCAR标记不能有效鉴定er1基因，主要由于PsMLO1（白粉病感病基因，MLO基因家族）位点存在不同碱基突变的er1等位基因，如er1-1～er1-7[5,16,27-33]。本研究采用与豌豆抗白粉病er1（Er1）、er2和Er3基因连锁的7个SCAR标记在抗病或感病资源中均有扩增，扩增出条带的资源比例均高于抗病资源所占比例，且6个分子标记扩增出条带的资源比例均在80%以上，虽有研究表明白粉病菌分为不同的毒力型，但没有充分证据表明其存在生理分化[13,26]，因此表明这7个分子标记均不能有效鉴定er1（Er1）、er2和Er3基因，需开发适用性更好的SSR分子标记。尽管利用7个分子标记不能有效鉴定豌豆资源是否含有er1（Er1）、er2和Er3基因，但7个分子标记仍可用于区分豌豆资源不同标记基因型，揭示豌豆资源的遗传多样性，本研究中7个分子标记将400份种质资源区分为39个标记基因型，且16份抗性种质资源分属7个不同标记基因型，可为培育抗白粉病豌豆品种组配不同来源的亲本提供参考依据。

目前，国外报道的豌豆抗白粉病种质资源中，尚未发现新的抗病基因及抗病位点。大部分抗病品种（资源）的抗性由er1基因控制，如Glenroy、Kiley、Mukta、ATC1181、M257-3-6、M257-5-1 和PSI11[34]；LE25、ATC823[34]和 JI210[14]，ATC649、ATC1036[34]和 Stratagem、JI1210[14]，Tara、AC Tamor[14]和955180[35]等材料；除er2基因的来源材料SVP 951和SVP 952外，受er2基因控制的抗豌豆白粉病品种只有1份，为JI 2480[14]；受显性基因Er3控制的抗豌豆白粉病资源是来自ICARDA的野生型豌豆P660-4[8]。本研究筛选到16份抗性种质资源，通过7个分子标记均不能有效判定是否含有抗白粉病er1、er2和Er3基因，因此推测其可能含有新的抗病基因位点或等位基因，将通过构建遗传群体，通过定位对抗白粉病基因进行进一步验证。

4 结论

筛选出了四川本地抗白粉病豌豆资源，明确了其在四川省的大致地理分布；并利用抗白粉病er1、er2和Er3基因的7个分子标记对400份豌豆资源进行了抗白粉病分子标记基因型鉴定，可为组配抗白粉病杂交组合提供参考依据，为四川豌豆抗白粉病育种研究提供有效的抗源材料，同时四川抗白粉病资源可在四川豌豆生产中直接被利用，促进豌豆产业发展。