二陈汤通过增强自噬改善痰湿型PCOS大鼠子宫葡萄糖转运功能的研究❋

丛培玮， 张丽娜， 赵丹玉， 尚 冰， 吴兆利

(1.辽宁中医药大学教学实验中心， 沈阳 110847； 2. 辽宁中医药大学中西医结合学院，沈阳 110847； 3. 辽宁中医药大学医史文献研究院，沈阳 110847； 4. 辽宁中医药大学针灸推拿学院，沈阳 110847)

排卵障碍一直被认为是多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)患者不孕的原因。随着促排卵药物的应用，PCOS患者排卵率可达80%，但因子宫病变导致的最终妊娠率只有40%～50%[1]。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)目前被认为是PCOS子宫病变重要的病理生理基础。近年来研究显示，PCOS子宫病变的发生率占PCOS患者的35%～49%[2，3]，其中痰湿型PCOS是目前临床最为多发的中医证型，该证型与IR关系密切[4]。降低患者子宫IR水平，改善子宫内环境，对提高临床妊娠率具有重要意义。课题组前期研究发现，基于“痰湿不孕”理论指导下的二陈汤对改善PCOS大鼠IR水平效果显著。本部分研究在前期研究基础上，观察痰湿型PCOS大鼠体质量增长率，动情周期、子宫组织病理形态、自噬相关基因7(autophagy related gene，Atg7)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter protein 4，Glut4)信号通路变化，进一步探讨二陈汤改善痰湿型PCOS子宫IR水平的可能机制。本研究已通过辽宁中医药大学动物实验伦理委员会审核，批准号2019YS(DW)-035-01。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级健康雌性Sprague-Dawley大鼠45只，4～5周龄，体质量85～105 g，由辽宁中医药大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(辽)-2010-0001。饲养于SPF级独立通风笼，温度(20±2) ℃，湿度(50±5)%，每日定时添加饲料，换水及灌胃给药。

1.2 药物制备

二陈汤组成：半夏12 g，陈皮9 g，茯苓15 g，甘草6 g(按临床治疗PCOS常用剂量)，购于辽宁中医药大学附属医院。药物经高压浓缩煎药机煎煮后过滤浓缩，根据大鼠体表面积换算人体等效剂量2倍的方法换算后[4]，混合浓缩为含量有生药为0.88 g/mL的水煎剂。二甲双胍购自辽宁中医药大学附属医院(规格0.5 g/片)，蒸馏水配制药物浓度为0.3 g/mL的水溶液。

1.3 试剂与仪器

Atg7(批号ab52472，Abcam)、PI3K(批号278545，Abcam)、Akt(批号ab8805，Abcam)、Glut4(批号ab216661，Abcam)、gapdh(批号ab9485，Abcam)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)Elisa试剂盒(批号SBI-R0930)，森贝伽生物科技有限公司；黄体生成素(luteinizing hormone，LH)Elisa试剂盒(批号SBJ-H2047)，森贝伽生物科技有限公司；睾酮(testosterone，T)Elisa试剂盒(批号SBJ-R0994)，森贝伽生物科技有限公司；雌二醇(estradiol，E2)Elisa试剂盒(批号SBJ-R0698)，森贝伽生物科技有限公司；空腹胰岛素(fasting insulin，FINS)Elisa试剂盒(批号WLB-0690R1)，北京威莱博生物技术有限公司。

酶标仪(Bio-Rad，042BR14173)，化学发光成像系统(上海天能科技有限公司，Tanon5200)，生物显微镜(Leica，DM750)，电泳仪、转膜仪(Bio-Rad，Trans-Blot Turbo Transfer Systerm)，血糖仪(拜耳，contour TS)。

1.4 动物分组、造模及给药

大鼠适应性喂养1周，选取动情周期规律SD大鼠42只，随机分为对照组10只，模型组32只，模型组给予高脂饲料连续喂养12周，第3周开始每日灌胃来曲唑溶液，连续9周；对照组给予常规饲料喂养12周，第3周开始每日灌胃0.5% CMC-Na溶液，连续9周。造模结束后，周期延长的模型组大鼠随机抽取20只，分为中药组(10只，含生药量为0.88 g/mL)和二甲双胍组(10只，含生药量为0.3 g/mL)，按1 mL/100 g剂量灌胃给药，连续4周。高脂饲料成分包括酪蛋白800kcaL，L-胱氨酸12kcaL，玉米淀粉291kcaL，麦芽糊精400kcaL，蔗糖691kcaL，豆油225kcaL，猪油1598kcaL，复合维生素40kcaL，由辽宁中医药大学动物实验中心配送。

2 标本与检测

2.1 动情周期检测

通过观察阴道脱落细胞涂片鉴定各组大鼠的发情周期。采用50 μL移液器吸取生理盐水，在大鼠阴道内来回抽吸3～5次。将吸出的生理盐水滴到干净的载玻片上，苏木素染色后置于光学显微镜下观察并记录，每天固定同一时间进行操作。

2.2 子宫病理组织HE染色

造模结束各组大鼠24 h禁食水后，于冰上取子宫组织，4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋，4 μm厚切片，常规脱蜡水化后，苏木素染色15 min，1%盐酸酒精分化，伊红染色、脱水、透明后中性树胶封片，镜下观察。

2.3 血清激素水平和HOMA-IR指数测定

造模结束各组大鼠24 h禁食水后，2%戊巴比妥钠(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血5～8 mL，3500 r/min 离心10 min取上清。Elisa法检测FSH、LH、T、E2、FINS水平。尾尖静脉取血，拜耳血糖仪测定空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)水平，计算HOMA-IR = FPG(mmol/L)× FINS(mIU/ L)/22.5。

2.4 Western Blot法检测子宫组织Atg7、PI3K、Akt、Glut4含量的表达

蛋白裂解液提取总蛋白，Bradford试剂盒蛋白定量。每孔上样量为50 μg，SDS-PAGE电泳，半干转膜，TBST封闭1 h，加入兔抗大鼠Atg7(1∶1000)、PI3K(1∶1000)、Akt(1∶1000)、Glut4(1∶1000)一抗，4 ℃封闭过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶2000)，1 h后TBST洗膜3次，加入增强型ECL发光液反应5 min，化学发光成像系统曝光，拍照，ImageJ软件数据分析每条泳道的光密度值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 动情周期观察

图1示，光镜下观察各组大鼠涂片，对照组可见动情周期规率，每只平均4～5 d；模型组表现为动情间期延长，周期不规律。经中药组和二甲双胍组治疗后的涂片示，动情周期逐渐改善。各时期细胞特征为，动情前期主要分布有核上皮细胞，动情期分布大量角化细胞，动情后期可见有核上皮细胞、无核角化细胞及白细胞，动情间期则分布大量的白细胞。

注：红色箭头标示有核上皮细胞，黄色箭头标示无核角化细胞，绿色箭头标示白细胞

3.2 各组大鼠子宫组织病理形态学观察

图2示，对照组大鼠子宫形态基本正常，内膜腺体数目较多，腺腔大而多褶。模型组大鼠子宫内膜腺体数目明显减少，腺体多为单个分散排列，腺腔小而直。中药组和二甲双胍组子宫内膜腺体数目增多，腺腔形态有所恢复，部分可见到皱褶和分支。

注：A(对照组)；B(模型组)；C(中药组)；D(二甲双胍组)

3.3 二陈汤对血清激素水平和HOMA-IR指数的影响

图3示，与对照组比较，模型组大鼠血清LH、FSH、T水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，E2水平有所减低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，中药组和二甲双胍组血清中LH、FSH、T水平明显降低(P<0.05)，E2水平有所升高(P>0.05)。与对照组比较，模型组HOMA-IR升高显著(P<0.05)，与模型组比较，中药组和二甲双胍组HOMA-IR降低显著(P<0.05)。

注：与对照组比较：aP<0.05；与模型组比较：bP<0.05；control(对照组)；model(模型组)；CTM(中药组)；metformin(二甲双胍组)

3.4 二陈汤对子宫组织Atg7、PI3K、Akt及Glut4蛋白的影响

图4示，与对照组比较，模型组大鼠子宫Atg7、PI3K、Akt、Glut4蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药组和二甲双胍组大鼠子宫Atg7、PI3K、Akt、Glut4蛋白表达水平有不同程度的改善(P<0.05)。

注：与对照组比较：aP<0.05；与模型组比较：bP<0.05；control(对照组)；model(模型组)；CTM(中药组)；metformin(二甲双胍组)

4 讨论

中医学认为痰是病理性的产物。元·朱丹溪最早提出痰湿不孕[5]：“肥盛妇人，禀质甚厚，恣于酒食之人，经水不调，不能成胎，谓之躯脂满溢，闭塞子宫，宜行湿燥痰。”脾虚津液失布，聚而生痰，痰阻胞宫可致女子不孕。因此，脾虚痰湿、壅塞胞宫是PCOS子宫病变的关键病机。中医临床发现，PCOS患者多为痰湿型体质[6]。张锦聪[7]等通过调查发现，182名PCOS患者的中医证候要素中痰湿型位居病性类证候要素的首位。

现代中医认为，长期脾虚痰湿可诱发糖脂分解产能方式的转变，是机体IR发生的重要原因[6]。长期以来，IR被认为是PCOS重要的病理生理基础。随着研究深入，学者们普遍认为PCOS患者存在子宫局部IR现象，同时全身IR也会影响子宫功能，PCOS-IR患者子宫内膜病变所致流产更是逐年攀升[7]。二陈汤出自《太平惠民和剂局方》，具有健脾益气、燥湿化痰的功效。半夏为君，陈皮为臣，达燥湿化痰；佐以茯苓健脾利湿，使以甘草调和诸药。课题组前期运用网络药理学对二陈汤分析发现，二陈汤主要成分代谢物涉及的相关信号通路与糖脂代谢关系密切[8]。本研究在“痰湿不孕”理论指导下，探讨二陈汤对痰湿型PCOS大鼠的保护作用。前期研究发现，该方药主要成分能有效改善PCOS大鼠血脂水平和颗粒细胞IR水平[9]。在此基础上，本实验进一步探讨二陈汤防治PCOS子宫IR的可能作用机制。

本次研究发现，药物治疗后子宫内膜腺体数目、腺腔形态均有所恢复，部分可见到皱褶和分支。药物治疗后血清中LH、FSH、T水平明显降低，E2水平有所升高，HOMA-IR降低显著，提示二陈汤在改善PCOS子宫功能及IR水平有一定作用。

PI3K/Akt通路与PCOS中生殖内分泌水平密切相关[10，11]。各种细胞因子和信号传导复合物(如胰岛素)可激活下游PI3K，介导Akt活化，促进Glut4从胞浆向胞膜转位。胚胎种植过程中，子宫需要摄取大量葡萄糖以维持子宫所需的能量。当子宫组织葡萄糖摄取能力受损，会引发一系列如子宫内膜细胞与胚胎黏附能力降低[12，13]、内膜容受性降低和内膜癌变等病理改变[14，15]。本研究中子宫组织PI3K、Akt、Glut4蛋白表达结果显示，与对照组比较，模型组大鼠子宫PI3K、Akt、Glut4蛋白表达显著降低；与模型组比较，经过中药或二甲双胍治疗后的大鼠子宫PI3K、Akt、Glut4蛋白表达有不同程度的改善。

另一方面，大量研究证实IR状态下组织的自噬功能会出现异常。Chan等[16]在高脂饮食诱导的糖尿病小鼠和基因缺陷肥胖小鼠中，均发现肝细胞内多种自噬相关基因的表达降低，自噬功能严重受损。自噬过程涉及到30多种自噬相关基因，Atg7在自噬通路中起核心作用[17，18]。特异性敲除Atg7小鼠的肝脏发现，Akt活性降低，IR严重。Atg7表达恢复，Akt活性增强，IR得到缓解[19]。本研究发现，与对照组比较，模型组大鼠子宫Atg7蛋白表达显著降低；与模型组比较，经过中药或二甲双胍治疗后的大鼠子宫内Atg7蛋白表达有显著增高。

目前认为自噬失调会影响PCOS子宫功能，PI3K/Akt/Glut4通路在PCOS中发挥作用，但二者之间的联系尚无报道。本研究认为，二陈汤能够显著抑制PCOS的IR水平，其机制可能是通过提高子宫内膜的自噬能力，进而增强PI3K/Akt/Glut4信号通路实现，但其详细的调控机制课题组将在体外研究中进一步探究。