长链非编码RNA FAL1 对胃癌细胞增殖和凋亡能力的影响及机制研究

曹献馗 谢 斌 邵 旸 林 杰

辽宁省肿瘤医院普外科，辽宁沈阳 110042

胃癌（gastric cancer，GC）是常见的消化道肿瘤[1]，患者早期无明显症状[2]，导致诊断延迟，转移率高[3]，寻找有效的靶点对治疗GC 至关重要[4]。GC 的发生发展与基因调控网络的失衡密切相关[5]，人类基因组中存在大量的非编码蛋白质的RNA[6]。其中，长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）参与转录调控和染色质修饰等生理过程，在肿瘤发生中具有重要作用[7]，与肿瘤的发展密切相关[8-9]。本研究显示lncRNA FAL1 在GC 细胞中过表达，参与肿瘤增殖和凋亡。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 细胞培养及转染

人胃腺癌细胞株SGC-7901、BGC-823 及正常胃黏膜细胞GES-1 取自辽宁省肿瘤医院中心实验室。所有细胞系均在含10%胎牛血清（Hyclone，通用生命科学，美国）DMEM 培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium，sigma，美国）中培养，另加100 U/ml 链霉素和100 U/ml 青霉素（Thermo Fisher Scientific，美国）。培养条件为37℃，5%CO2。设计并合成了2 种以FAL1为靶点的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA；genechem，中国），分别为si-FAL1#1 组及si-FAL1#2组。构建STAT3 过表达pcDNA3.1 质粒（Invitrogen，美国）。细胞接种于六孔板，密度1.8×105/孔，并置于37℃培养条件24 h。细胞于含10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM 中培养基转染相应载体48 h。收集细胞进行相关实验。

1.2 RT-PCR

TRIzol 法提取样本总RNA，检测纯度及浓度。逆转录和PCR 反应均严格按照TAKARA 公司说明书进行，以U6 作为内参进行相对定量，每组设3 个复孔，ROCHE 实时定量荧光PCR 仪进行检测。FAL1 的正向引物序列：5’-CCTGGCCAAGAAGCTCATAG-3’，反向引物序列：5’-TGAGGACACCGACTACTGAGAA-3’；STAT3 的正向引物序列：5’-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3’，反向引物序列：5’-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3’；U6 的正向引物序列：5’-TTATGGGTCAGGCAGAAGCAGAGGTAGCTAGCCTGAC-3’，反向引物序列：5’-CACTATTGCGGGCTGC-3’。采用2-△△Ct法计算两者的相对表达量。△Ct=Ctmarker-CtU6。PCR 条件：95℃，5 min；95℃，30 s；8℃，30 s；72℃，45 s；32 个循环，72℃，10 min。

1.3 Western blot

提取总蛋白，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE；Beyotime，中国）。随后，转移到硝基纤维素膜（Millipore，美国）。室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后与STAT3（1∶1000，Proteintech，美国）和β-actin（1∶5000，Proteintech，美国）孵育过夜。膜洗涤3 次，二抗（1∶5000，Proteintech，USA）室温孵育1 h，显影成像，ImageJ 分条带灰度值。

1.4 CCK-8

依据CCK-8 系统（Dojindo，日本）测定细胞活力。细胞接种在96 孔板中（每孔1×104个细胞）。细胞于37℃黑暗孵育，于培养0、24、48、72 h 每孔加入10 μl CCK-8 溶液，再孵育4 h。然后使用酶标仪（Tecan，瑞士）在450 nm 处评估每个孔的吸光度。

1.5 Annexin V-FITC PI 双染色检测细胞凋亡

细胞处理后，用4℃PBS 对细胞进行胰蛋白酶化和洗涤。根据操作手册，使用Annexin V/PI 检测试剂盒（Molecular Probes Inc.Eugene，OR）在黑暗中孵育细胞悬液15 min。流式细胞术检测细胞凋亡（Beckman Coulter，USA），实验重复3 次。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验或方差分析。计数资料以例数表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAL1、STAT3 在GC 细胞及胃黏膜上皮细胞中表达情况

RT-PCR 显示，FAL1 在人胃腺癌细胞株SGC-7901和BGC-823 中RNA 的表达高于胃黏膜细胞GES-1中表达，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图1A。RTPCR 和Western blot 显 示，STAT3 在SGC-7901 和BGC-823 中mRNA 表示高于GES-1，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图1B～C。

图1 FAL1、STAT3 在GC 细胞及胃黏膜上皮细胞中表达情况

2.2 下调FAL1 对STAT3 表达的影响

RT-PCR 显示，转染后GC 细胞中FAL1 表达量降低（P ＜0.05），见图2A。胃癌细胞中STAT3 的表达同样下降（P ＜0.05），见图2B。其中第2 条序列（si-FAL1#2）具有更好的沉默效果，用于后续表型实验。

图2 下调FAL1 对STAT3 表达的影响

2.3 FAL1、STAT3 对GC 细胞增殖能力的影响

将si-FAL1#2 序列转染SGC-7901 和BGC-823细胞后，细胞增殖减缓。在此基础上过表达STAT3，被抑制的细胞的增殖能力部分恢复（P ＜0.05）。见图3。

图3 FAL1 和STAT3 对GC 细胞增殖能力的影响

2.4 FAL1、STAT3 对GC 细胞凋亡能力的影响

将si-FAL1#2 转 染SGC-7901 和BGC-823 细胞，细胞早期凋亡明显增加，过表达STAT3 后，凋亡细胞降低（P ＜0.05）。见图4。

图4 FAL1 和STAT3 对GC 细胞凋亡能力的影响

3 讨论

阐明胃癌进展的遗传和表观遗传学机制是研究重点，但其机制仍未明确[10-11]。LncRNAs 作为转录组的重要组成部分，根据其位置及转录方式可分为：反义，内含子，重叠，长链基因间lncRNA，头对头及eRNA等多种类型[12]。lncRNA 在不同肿瘤中异常表达[13-14]，通过表观遗传修饰、转录调控及转录后修饰，调控肿瘤相关基因表达，参与肿瘤发生发展[15-16]。报道显示lncRNA 作为抗乳腺癌治疗肿瘤的靶点，具有一定的临床价值[17]。血液中游离的lncRNA 是肺癌诊断的分子标志物[18]。lncRNAs 在GC 中也存在异常表达：Zhang等[19]对GC 患者组织及正常组织中LncRNA 进行了筛选，发现TINCR、CCAT2、AOC4P、BANCR、LINC00857等在GC 中表达上调。Wang 等[20]发现LncRNA UCA1通过促进Cbl-c 介导的GRK2 泛素化调节GRK2 蛋白的稳定性，提高GC 细胞的转移能力。

FAL1 是一条新发现的lncRNA，在肿瘤中发挥重要的功能：FAL1 在骨肉瘤组织和细胞中高表达，同肿瘤的转移、分期和生存率密切相关，下调FAL1 可以抑制骨肉瘤的增殖、侵袭、迁移和上皮-间质转化，从而抑制骨肉瘤的进展[21]。FAL1 可与PRC1 的BMI1 亚基结合，抑制靶基因p21 的启动子，导致细胞周期失衡，加速卵巢癌进展[22]。FAL1 作为“海绵”，与miR-1236 结合促进细胞增殖和转移[23]。然而，FAL1 在胃癌中的作用尚不清楚。

STAT3 参与AK/STAT 通路的激活，该通路广泛参与细胞增殖、迁移和侵袭[24]。Wu 等[25]研究发现肿瘤相关成纤维细胞分泌IL-6，激活GC 细胞的JAK2/STAT3 信号通路，促进GC 细胞的迁移和上皮间质转化。本研究发现，在抑制FAL1 的表达后，STAT3 的mRNA 和蛋白表达均下降。而且在下调FAL1 的表达后，细胞增殖能力下降，凋亡增加；在此基础上过表达STAT3，被削弱的恶性表型恢复，这提示FAL1 在GC中的促癌作用是通过STAT3 实现的。

综述所述，lncRNA FAL1 和STAT3 协同作用，促进GC 的恶性增殖，并抑制细胞凋亡，后续将在在体模型中对此进行验证，并探讨STAT3 在GC 中的下游调控机制。