复合蛋白酶在糖蜜无外加酸发酵酒精中的研究应用

尚红岩，郭艺山，邓毛程*，李 静，张远平，吴亚丽，郑子鑫，殷德运，梁彭生，缪秉潮，林群珊，杨凤婷，孔银莹

(1广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院，广东广州510300；2广东省科学院生物与医学工程研究所，广东广州510316)

0 前言

由于糖蜜富含可发酵性糖和营养素，是培养酵母和发酵酒精的优良原料，但糖蜜储运过程很难无菌操作，不可避免有杂菌滋生。糖蜜酒精生产通常需要添加硫酸抑制杂菌，使用硫酸抑菌不仅容易造成设备腐蚀和积垢，废液中的硫酸根离子还会污染环境，增加酒精废液处理难度[1-2]。20世纪90年代，国内开始糖蜜酒精无酸发酵技术研究，传统无酸发酵技术主要是通过高温灭菌和添加抗生素代替硫酸抑制杂菌，由于高温灭菌能耗大，且容易造成糖蜜焦糖化；而抗生素等杀菌剂灭菌会产生耐药性[3-6]。进入21世纪，利用复合酶制剂替代硫酸抑菌的无酸发酵新工艺，成为研究热点，由于酶制剂是环境友好型的生物制剂，该技术成为糖蜜酒精生产技术发展的趋势[7-9]。本文以复合蛋白酶加入糖蜜中抑菌，对比传统硫酸酸化糖蜜抑菌，进行酵母培养和连续发酵酒精研究，以发酵醪液含酒分(酒精含量)和残还原糖判断发酵产酒率，以细菌代谢产生的挥发酸衡量杂菌感染程度。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

复合蛋白酶(蛋白酶类、淀粉酶和果胶酶等)，广东轻工职业技术学院食品与生物技术学院配制；酵母菌种：高活性糖蜜酒精干酵母(广东省科学院生物与医学工程研究所)；甘蔗糖蜜(广西凤糖生化股份有限公司)；青霉素(广州蓝华江兽药有限公司)；尿素、浓硫酸、过磷酸钙、硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、中性醋酸铅溶液、磷酸盐草酸盐混合溶液(脱铅剂)、裴林氏甲乙溶液、1%次甲基蓝示溶液、0.1%酚酞指示液、10%稀硫酸(广州化学试剂厂)。

1.2 仪器设备

酒度计(0～30)，上海精密仪器厂；电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；自制5级连续玻璃柱反应器(1 L)，益贤机械设备有限公司；蠕动泵(L100-1E)，兰格恒流泵有限公司。三角瓶500 mL、容量瓶250 mL、量筒5000 mL、蒸馏烧瓶250 mL、冷凝蛇管、电炉2500 W、温度计、锤度计、恒温培养箱、水浴锅、显微镜、血球计数板。

2 试验方法

2.1 糖蜜培养液和发酵液制备

添加复合蛋白酶糖蜜培养液(以下简称“复合蛋白酶糖蜜”)：糖蜜用自来水稀释至18ºBx浓度，添加0.3%的硫酸铵，添加复合蛋白酶30 g/t糖蜜。

硫酸酸化糖蜜培养液(以下简称“糖蜜酸化液”)：糖蜜用自来水稀释至18ºBx浓度，添加0.3%的硫酸铵，用浓硫酸调节至pH 3.8。

发酵糖液：原糖蜜加自来水稀释浓度45ºBx。

2.2 发酵方法

2.2.1 复合蛋白酶糖蜜酵母培养及连续发酵

采用双浓度双流加连续发酵工艺，1#号反应器加入糖蜜复合蛋白酶培养液300 mL，接种活性干酵母0.5%，进行酵母活化起种，当培养液酵母数达到1.5亿/mL时，开始通过蠕动泵连续流加糖蜜复合蛋白酶培养液，流加速率1.2～1.4 mL/min，约12～14 h加满1#号反应器，反应器培养液锤度控制在9～10ºBx，发酵温度控制为30～31℃；1#号反应器液位满至过料管时，经过料管流入2#号反应器内，即可开始通过蠕动泵连续流加发酵液进入2#号反应器，流加速率2.4～2.8 mL/min，约6～8 h左右加满2#号反应器，反应器发酵液锤度控制在17～19°Bx，发酵温度控制为31～33℃。当2#号反应器加满后，发酵液经过料管进入3#号反应器。3#号反应器加满后依次连续流入下一级反应器，直至加满5#号反应器。连续发酵5天，每天从1#号和5#号反应器分别取样2次，分析发酵液的酒分、挥发酸和5#号反应器发酵液残还原糖。

2.2.2 糖蜜酸化液培养酵母及连续发酵

采用双浓度双流加连续发酵工艺，1#号反应器加入糖蜜酸化培养液300 mL，接种活性干酵母0.5%，进行酵母活化起种，当培养液酵母数达到1.5亿/mL时，开始通过蠕动泵连续流加糖蜜酸化培养液，流加速率1.2～1.4 mL/min，约12～14 h加满1#号反应器，发酵温度控制为30～31℃；1#号反应器液位满至过料管时，经过料管流入2#号反应器内，即可开始通过蠕动泵连续流加发酵培养液进入2#号反应器，其他操作步骤同2.2.1。连续发酵5天，每天从1#号和5#号反应器分别取样2次，分析发酵液的酒分、挥发酸和5#号反应器发酵液残还原糖。

2.3 分析方法

⑴发酵酒精浓度：采用蒸馏-酒度计法。量筒量取100 mL发酵液，放入蒸馏烧瓶内，用100 mL蒸馏水冲洗量筒，也放入蒸馏烧瓶内，蒸馏并收集馏出液100 mL，用酒度计测定馏出液酒精浓度[10]。

⑵酵母菌数量：用血球计数板测定酵母培养液和发酵液中的酵母菌数量[10]。酵母液用蒸馏水稀释10倍，摇匀后滴一滴到血球计数板，放置在显微镜下计数。

⑶发酵液残糖分：用兰因-艾农(Lane-Eynon)恒容法[10]测定发酵液残糖分(残还原物)。发酵液经过滤除杂后做成检液，滴定裴林氏甲乙液，记录滴定的毫升数并计算。

⑷挥发酸：用碱液滴定法测定发酵蒸馏酒液的挥发酸[10]。取酒精馏出液50 mL，加入0.1%酚酞指示剂2滴，用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色在30 s内不消失为止，记录消耗NaOH溶液的毫升数。

3 结果与分析

3.1 添加复合蛋白酶糖蜜发酵液结果

添加复合蛋白酶糖蜜连续发酵1#号和5#号反应器，每天取样测定发酵液酒分、挥发酸和成熟醪液残还原糖，分析结果见表1和表2。由于发酵液连续流加到5#号反应器需要30 h以上，第2天才能取到5#号反应器发酵液分析样品，5#号反应器从第2～6天取样测定发酵液酒分、挥发酸和残还原糖。

表2 添加复合蛋白酶糖蜜发酵5#号反应器发酵数据

3.2 酸化糖蜜发酵结果

酸化糖蜜连续发酵酒精1#号和5#号反应器，发酵液酒分、挥发酸和残还原糖等结果见表3和表4。

表3 酸化糖蜜发酵1#号反应器发酵数据

表4 酸化糖蜜发酵5#号反应器发酵数据

3.3 分析与讨论

3.3.1 1#号反应器结果分析

⑴酒分

1#号反应器采用添加复合蛋白酶糖蜜和硫酸酸化糖蜜培养酵母，发酵含酒分对比见表1、表3和图1，从图表中可以看出，添加复合蛋白酶的糖蜜发酵含酒分从第2天开始在6.0%以上，到第5天升高至6.50%以上，明显高于酸化糖蜜最高发酵酒分6.2%左右。原因是复合蛋白酶抑菌的同时，还可将糖蜜中的蛋白质和多糖水解为酵母可以利用的物质，提高了发酵含酒分。

图1 1#号反应器发酵含酒分对比

⑵挥发酸

挥发酸是产酸细菌代谢产物，感染细菌越多挥发酸越高。从表1和表3数据可得出2种抑菌糖蜜培养酵母挥发酸变化趋势，如图2所示。从图中可以看出，添加复合蛋白酶的糖蜜发酵液挥发酸最高至0.113 g/L，明显低于酸化糖蜜发酵液挥发酸含量，说明复合蛋白酶抑菌效果好于硫酸酸化。

图2 1#号反应器发酵挥发酸对比

3.3.2 5#号反应器结果分析

采用添加复合蛋白酶糖蜜和硫酸酸化糖蜜培养酵母，流加发酵糖液连续发酵，到5#号反应器发酵基本完全。从表2可以看出添加复合蛋白酶糖蜜成熟醪含酒分可达到12%左右，残还原糖1.7%以下， 挥发酸0.159 g/L以下，明显优于硫酸酸化糖蜜的发酵酒分、残还原糖和挥发酸含量。具体分析如下：

⑴酒分

从表2和表4复合蛋白酶和酸化2种抑菌糖蜜发酵数据，得出5#号反应器发酵含酒分对比图，如图3所示。从图中可以看出，添加复合蛋白酶的糖蜜经过5天连续发酵，发酵成熟醪含酒分可以稳定在12%左右，明显高于酸化糖蜜发酵含酒分11.2%左右。一方面因为复合蛋白酶抑制杂菌，使酵母能将糖蜜中可发酵性糖发酵完全；另一方面复合蛋白酶还可将糖蜜中的蛋白质和多糖水解为酵母营养物和可发酵性糖，提高了发酵含酒分。

图3 5#号反应器发酵含酒分对比

⑵残还原糖

从表2、表4和图4可以看出，添加复合蛋白酶的糖蜜经过5天连续发酵，发酵成熟醪残还原糖可以控制在1.7%以内，而酸化糖蜜发酵残还原糖只能控制在2.1%以内。原因是复合蛋白酶可将糖蜜中的多糖水解为可发酵性糖，酵母将可发酵性糖发酵完全；而硫酸酸化无法分解糖蜜中的多糖，残还原糖相对偏高。

图4 5#号反应器发酵成熟醪残还原糖对比

⑶挥发酸

从表2、表4和图5可以看出，添加复合蛋白酶的糖蜜经过5天连续发酵，发酵成熟醪液挥发酸控制在0.159 g/L以下，明显低于酸化糖蜜发酵挥发酸含量，复合蛋白酶抑制杂菌效果优于硫酸酸化。

图5 5#号反应器发酵成熟醪残挥发酸对比

4 结论

以添加复合蛋白酶的糖蜜进行连续酵母培养和发酵酒精研究，经过5天连续发酵，1#号反应器酵母培养液含酒分为6.50%以上，5#号反应器发酵成熟醪含酒分可达到12%左右，残还原糖1.7%以下，挥发酸0.159 g/L以下，都明显优于传统硫酸酸化糖蜜的发酵酒分、残还原糖和挥发酸含量。复合蛋白酶一方面能够抑制杂菌，使酵母充分繁殖并获得对杂菌的生长优势，使挥发酸降低，并将糖蜜中糖分发酵完全；另一方面复合蛋白酶还可将糖蜜中的蛋白质和多糖水解为氨基酸等酵母营养物和可发酵性糖，提高酵母发酵活性，可明显提高发酵含酒分，并减少发酵成熟醪残还原糖的含量[11-12]。以复合蛋白酶代替硫酸的糖蜜无酸发酵酒精技术可以获得更高的发酵产酒率。