肺癌组织中长链非编码RNA-H19的表达与患者免疫功能、炎症反应因子及预后的关系

周建英 刘震天 胡珍珍 肖 丹

（江西省肿瘤医院，南昌330029）

肺癌是死亡率以及恶性程度较高的疾病，在历 年临床数据资料的统计中肺癌导致死亡的患者比率较其他癌症显著升高[1］。肿瘤细胞的增殖和不断转移是肺癌致死的主要原因，目前临床对于肺癌的治愈率很低，多数肺癌患者在接受手术治疗后会有疾病转移复发的可能，患者预后效果不佳[2-4］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类生物学功能广泛的RNA分子，研究指出其与多种肿瘤疾病的发展过程有关，并且有些LncRNA分子能够指导预后[5］。LncRNA-H19是一种被学术界广泛研究的标志基因[6］。ZHAO等[7］发现，LncRNA-H19能够在胚胎造血干细胞的发育过程中，抑制半胱氨酸水解酶活性，加速间质细胞的活化。并有学者在实验中证明，LncRNA-H19能够结合let-7促进滋养层细胞的成球黏附，从而对子宫内膜的修复过程产生作用[8-9］。有临床试验指出：LncRNA-H19的异常高表达与子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌和心脑血管疾病存在相关[10］。目前，未见LncRNA-H19与肺癌患者免疫功能、炎症反应因子以及临床预后关系的相关研究，因此本研究就此展开探索并报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 试验材料 总RNA提取试剂盒（上海晨易生物科技有限公司）、流式细胞仪（上海劲马实验设备有限公司）、IL-1β ELISA试剂盒（上海博灿生物科技有限公司）、IL-6 ELISA试剂盒（上海红荣微再生物工程技术有限公司）、TNF-α ELISA试剂盒（武汉华美生物科技有限公司）。

1.1.2 一般资料 选择2015年1月至2016年12月于我院进行手术治疗的肺癌患者80例纳入研究，收集患者术中切除的肺癌及其相应的癌旁组织。其中Ⅰ期29例、Ⅱ期10例、Ⅲ期11例、Ⅳ期30例，男性50例、女性30例，患者的平均年龄为（48.77±10.34）岁，患者平均BMI为（21.35±2.31）kg/m2，统计患者的TNM分期，按照临床规律将患者分为两组：高期（Ⅲ～Ⅳ期）、低期（Ⅰ～Ⅱ期）。纳入标准：①经病理确诊为肺癌；②患者的一般临床资料完整；③未合并其他肿瘤以及免疫系统疾病。排除标准：①有过靶向药物治疗史；②有过放化疗和免疫治疗史患者；③合并其他脏器类疾病患者。80例参试者及其家属皆充分了解试验内容并签署知情同意书，本试验通过我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR法检测LncRNA-H19的表达 将收集的肺癌组织以及癌旁组织剪碎，于液氮中研磨。总RNA提取试剂盒提取总RNA。定量聚合酶锁链反应检测LncRNA-H19的表达量，采用2－ΔΔCT法计算组织中LncRNA-H19的相对表达量。实验步骤严格按照相关仪器和试剂盒的说明书进行。Ln‐cRNA-H19的相对表达量≥3为LncRNA-H19高表达组，<3为LncRNA-H19低表达组。

1.2.2 免疫功能指标检测 以免疫比浊法对患者外周血清中IgA、IgG、IgM等免疫球蛋白指标进行检测；并在同一时间点采集患者的静脉血，通过流式细胞仪对CD3+、CD4+、CD8+等T细胞亚群进行检测，计算出CD4+/CD8+值。

1.2.3 炎症反应因子检测 采用ELISA法检测肺癌患者血清中炎症反应因子IL-1β、IL-6以及TNF-α水平，操作按照IL-1β ELISA、IL-6 ELISA以及TNF-α ELISA试剂盒的操作说明进行。

1.2.4 随访 采用门诊复查及电话随访方式对80例肺癌患者进行术后跟踪随访，了解其生存情况。每6个月随访1次，随访总周期36个月。

1.3 统计学方法 统计学分析采用SPSS19.0软件，计数资料用±s形式表示，组间比较采用T检验和卡平方检验，三组及以上组比较行F检验，Pearson相关性分析LncRNA-H19与免疫功能指标和炎症反应因子的相关性，Cox单因素和多因素分析进行影响肺癌患者总生存期的相关因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA-H19在肺癌及癌旁组织中的表达LncRNA-H19在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P<0.05），见图1；Ⅰ期肺癌组织中LncRNA-H19的相对表达量（2.48±0.64）较癌旁组织中（1.13±0.56）高（P<0.05）；由于Ⅱ期和Ⅲ期的表达水平基本一致，对两期进行合并临床阶段分析，LncRNAH19在Ⅱ～Ⅲ期肺癌组织（3.84±0.72）以及Ⅳ期肺癌组织中（4.85±0.83）的相对表达量较癌旁组织中（1.13±0.56）显著升高（F=15.342，P=0.001），见图2。提示随着肺癌组织的分期越高，LncRNA-H19的相对表达越高。

图1 肺癌及癌旁组织中LncRNA-H19的表达Fig.1 Expression of LncRNA-H19 in lung cancer and paracancerous tissues

图2 不同临床分期肺癌及癌旁组织中LncRNA-H19的表达Fig.2 Expression of LncRNA-H19 in different clinical stages of lung cancer and adjacent tissues

2.2 LncRNA-H19表达与临床病理特征的关系LncRNA-H19的相对表达量与肺癌患者的性别、年龄以及肿瘤的组织学类型无关（P>0.05）；而与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度、TNM分期以及淋巴结是否转移有关（P<0.05），见表1。

表1 LncRNA-H19表达与临床病理特征关系比较Tab.1 Comparison of relationship between LncRNA-H19 expression and clinicopathological characteristics

2.3 LncRNA-H19表达与患者免疫功能的关系与LncRNA-H19低表达组比较，LncRNA-H19高表达组患者血清免疫球蛋白指标含量显著下降（P<0.05）；且LncRNA-H19高表达组肺癌患者血清T细胞亚群的比例较LncRNA-H19低表达组患者显著下降（P<0.05），见图3、表2。提示肺癌组织中Lnc-RNA-H19的高表达常伴随患者免疫功能的下降。

表2 LncRNA-H19不同表达组患者T细胞亚群比较（±s，n=40）Tab.2 Comparison of T cell subsets in patients with different expression groups of LncRNA-H19（±s，n=40）

表2 LncRNA-H19不同表达组患者T细胞亚群比较（±s，n=40）Tab.2 Comparison of T cell subsets in patients with different expression groups of LncRNA-H19（±s，n=40）

Groups Low expression of LncRNA-H19 High expression of LncRNA-H19 T P CD3+（%）69.98±6.5450.23±5.465.2330.001 CD4+（%）38.77±3.2125.66±2.977.4210.001 CD8+（%）33.56±2.8522.31±1.786.5450.000 CD4+/CD8+（%）1.11±0.151.65±0.221.1010.012

图3 LncRNA-H19不同表达组患者免疫球蛋白指标比较Fig.3 Comparison of immunoglobulin indexes in patients with different expression groups of LncRNA-H19

2.4 LncRNA-H19表达与血清炎症反应因子的关系 与LncRNA-H19低表达组比较，LncRNA-H19高表达组肺癌患者血清中炎症反应因子表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。提示肺癌组织中LncRNA-H19的高表达伴随着机体炎症反应的加重。

图4 LncRNA-H19不同表达组患者血清炎症反应因子比较Fig.4 Comparison of serum inflammatory response fac⁃tors in patients with different expression groups of LncRNA-H19

2.5 LncRNA-H19表达与免疫功能指标和炎症反应因子的相关性 肺癌组织中LncRNA-H19的表达与患者血清免疫功能指标IgA、IgG、IgM、CD3+、CD4+、CD8+呈负相关（r<0，P<0.05）；与患者血清炎症反应因子IL-1β、IL-6和TNF-α的相对表达呈正相关（r>0，P<0.05），见表3。

表3 LncRNA-H19表达与免疫功能指标和炎症反应因子的相关性Tab.3 Correlation between LncRNA-H19 expression and immune function indexes and inflammatory re⁃sponse factors

2.6 LncRNA-H19与患者预后情况分析 随访期间，80例研究对象中44例肺癌患者死亡，36例存活。随访期间无失访患者。术后6个月时，Ln‐cRNA-H19低表达组与LncRNA-H19高表达组肺癌患者未出现死亡，生存率差异无统计学意义（P>0.05）；6个月后，LncRNA-H19高表达组肺癌患者的生存率较LncRNA-H19低表达组显著降低（P<0.05）；且随着随访时间的延长，两组生存率差异越大，见图5。

图5 不同LncRNA-H19表达组肺癌患者生存率比较Fig.5 Comparison of survival rates of lung cancer pa⁃tients in different LncRNA-H19 expression groups

2.7 影响肺癌患者总生存期的相关因素分析 单因素分析结果显示：LncRNA-H19、肿瘤分化程度、淋巴结是否转移以及肿瘤分期与肺癌患者的术后总生存期有关，差异有统计学意义（P<0.05），将以上因素纳入Cox多因素分析发现，LncRNA-H19高表达、肺癌组织高分化、淋巴结转移以及TNM高分期是影响肺癌患者预后总生存期的独立危险因素，见表4。

表4 影响肺癌患者总生存期的相关因素分析Tab.4 Analysis of related factors affecting overall survival of lung cancer patients

3 讨论

肺癌是临床常见的一类恶性肿瘤，其致死率占癌症致死率的10%以上，肺癌已经渐渐成为危害人们生命健康的一大杀手[11-13］。近年来肺癌发病率正逐年攀升。2017年的相关报道指出，外科手术和免疫治疗技术的成熟为绝大部分癌症患者带来福音，但就肺癌手术的预后仍然值得关注，相关数据显示：肺癌患者术后3年总生存率在10%以下，术后无病生存率更低[14-15］。因此，了解肺癌的发生过程及其具体的分子机制，探索新型肿瘤分子标志物对于改善患者预后有着重要的意义。有报道称Ln‐cRNA-H19在患者肿瘤组织中的表达出现异常，其能够通过特异性吸附相关miRNA，影响相关酶类的合成，从而发挥其生物学效能；也有试验证明，Ln‐cRNA-H19在肿瘤组织中的表达能够提示患者的预后，这可能为治疗肺癌的靶向用药治疗方案提供新的思路[16-18］。因此本试验就LncRNA-H19在肺癌组织中的表达以及与患者免疫功能、炎症反应因子以及临床预后关系展开详细的研究。

本研究以80例肺癌患者为研究对象，通过检测LncRNA-H19表达、患者血清免疫球蛋白、T细胞亚群、炎症反应因子表达。比较LncRNA-H19在肺癌及癌旁组织中的表达及其与肺癌病理特征、免疫功能、炎症反应因子和预后的关系。结果发现Ln‐cRNA-H19在肺癌组织中的相对表达明显高于癌旁组织；且随着肺癌组织的分期越高，LncRNA-H19的相对表达越高，提示LncRNA-H19在肺癌的疾病发展过程中起着关键性的作用。相较于LncRNA-H19低表达组，LncRNA-H19高表达组肺癌患者血清中免疫球蛋白指标IgA、IgG、IgM和T细胞亚群的比例显著下降，血清中炎症反应因子IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量显著升高，说明肺癌组织中LncRNAH19的表达可能是通过影响患者的免疫功能以及直接或者间接地参与了肺癌患者体内的炎症反应从而进一步推进该疾病的进程[19］。肺癌组织中Ln‐cRNA-H19的表达与患者血清免疫功能指标IgA、IgG、IgM、CD3+、CD4+、CD8+负相关；肺癌组织中Ln‐cRNA-H19的表达与患者血清炎症反应因子IL-1β、IL-6和TNF-α的相对表达正相关，这一结果进一步证明了LncRNA-H19负向影响机体免疫功能以及正向促进炎症反应相关因子的增加从而促进炎症反应的作用。提示肺癌组织中LncRNA-H19的高表达往往伴随着患者免疫功能的下降以及机体炎症反应的加重。LncRNA-H19高表达肺癌患者的术后生存率较LncRNA-H19低表达患者显著降低（P<0.05）。死亡患者肺癌组织中LncRNA-H19的相对表达（2.77±0.85）较存活患者（1.75±0.50）显著升高（P<0.05），说明LncRNA-H19的高表达会导致患者不良预后的发生。多因素分析证实LncRNA-H19高表达、肺癌组织高分化、淋巴结转移以及TNM高分期是影响肺癌患者预后总生存期的独立危险因素。虽然以上结果证实LncRNA-H19在肺癌组织中的表达与免疫功能、炎症反应因子以及预后确有关系，但对LncRNA-H19进行干扰能否作为治疗肺癌的临床新方案尚需相关动物试验进一步明确。

综上所述，LncRNA-H19在肺癌组织中的表达增加，其高表达伴随患者免疫功能的下降和炎症因子的增加，并且能够提示患者的不良预后。