蓝萼甲素通过cyclinB1/CDK1途径诱导DU145细胞G2/M期阻滞①

朱琳琳 徐祉轩 张明明（新乡医学院医学检验学院，河南省分子检验与医学检验技术协同创新中心，河南省免疫与靶向药物重点实验室，新乡453003）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）发病率逐年升高，现已成为严重威胁亚洲男性健康的第二大恶性肿瘤，但相当一部分患者激素治疗不敏感或耐受，迫切需要寻找抗肿瘤效果明确但不良反应较小的药物。本研究选取的蓝萼甲素（glaucocalyxin A，GLA）是从传统中草药香茶菜中分离提取的活性成分，香茶菜作为中草药，用于清热解毒、抗菌消炎、抗肿瘤历史悠久。研究表明GLA具有良好的抗肿瘤作用，但机制尚不明确［1-4］。本研究检测GLA对人前列腺癌细胞系DU145细胞中周期蛋白B1（cy‐clinB1）、周期蛋白依赖性激酶1（cyclin-dependent ki‐nase1，CDK1）等细胞周期相关因子表达的影响，探讨GLA诱导细胞周期阻滞的作用机制，为GLA的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料人前列腺癌细胞系DU145细胞购自中科院上海细胞库。胎牛血清、RPMI1640培养液购自Gibco公司；GLA由新乡医学院药学院提供；Trizol试剂、逆转录酶（M-MLV）、实时荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物均由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成；所用抗体均购自美国CST公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒、流式细胞周期检测试剂盒购自江苏碧云天生物技术公司；流式凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1 实验分组实验设空白对照组、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml GLA组，4组细胞培养基均含10%胎牛血清、100 U/ml双抗（青链霉素），培养环境为37℃、5%CO2。空白对照组不加GLA，其他各组细胞贴壁后分别加入相应浓度GLA刺激培养。

1.2.2 细胞增殖4组细胞接种于96孔板中，每孔体积100 μl，约2 000个细胞，细胞贴壁后加药。各孔分别加入10 μl CCK-8溶液，96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h，取出96孔板，置于酶标仪检测位，振荡混匀后，酶标仪450 nm测定各孔标本吸光度。

1.2.3 细胞周期细胞接种于6孔板中，约1×106个/孔，各孔细胞数量均匀。细胞贴壁后加药，加药后培养24 h，按试剂盒操作说明收集固定细胞，染色，上机检测分析。

1.2.4 细胞凋亡细胞接种于6孔板中，约1×106个/孔。细胞贴壁后加药培养24 h，收集细胞。预冷PBS洗涤细胞，Binding Buffer重悬细胞，Annex‐in V-FITC标记后避光、室温孵育15 min，PI染色后上机检测分析。

1.2.5 Real-time PCR Trizol一步法提取细胞总RNA，异丙醇法浓缩RNA，对RNA浓度和质量检测后进行逆转录，并按试剂盒操作说明完成qRTPCR。qRT-PCR反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性15 s与60℃退火/延伸60 s进行40个循环，最后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法（其中Ct值为循环阈值）分析mRNA的相对表达水平。所用引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列Tab.1 Primers used in real-time PCR

1.2.6 Western blot提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后依次转膜、室温封闭、孵育一抗（p21、cyclinB1、CDK1为1∶1 000稀释）4℃过夜、孵育HRP-二抗（1∶5 000稀释）室温摇床1 h，洗膜后曝光扫描，以目的蛋白与β-actin蛋白条带灰度值的比值，作为其相对表达量。

1.2.7 免疫荧光采用爬片：在24孔板中培养DU145细胞，细胞贴壁后加药刺激24 h，PBS洗涤细胞后4%多聚甲醛室温固定30 min，0.5%TritonX-100室温通透15 min，室温封闭90 min，一抗孵育（cyclinB1、CDK1分别为1∶400、1∶100稀释），4℃过夜，荧光二抗（1∶400稀释）室温避光孵育1 h，DAPI染色，应用荧光显微镜检测蛋白在细胞中的定位分布。

2 结果

2.1 GLA抑制DU145细胞增殖各组细胞按相应药物浓度分别刺激培养1 h、6 h、12 h、24 h、48 h，检测细胞增殖情况。结果显示，与对照组相比，1 μg/ml GLA对细胞增殖的影响无统计学差异（P>0.05）；2.5 μg/ml与5 μg/ml GLA能够抑制细胞增殖，5 μg/ml GLA的抑制效果更为显著（P<0.01），见图1。可见GLA抑制DU145细胞增殖的作用呈现剂量依赖效应。

图1 DU145细胞增殖曲线Fig.1 Proliferation curve of DU145 cells

2.2 GLA阻滞DU145细胞周期与对照组相比，1 μg/ml GLA对细胞周期的影响并无统计学差异。随着浓度增加，GLA显现出阻滞细胞周期的作用，当5 μg/ml GLA刺激培养DU145细胞24 h后，细胞周期明显停滞于G2/M期（P<0.01），见图2。GLA阻滞DU145细胞周期的作用呈现出明显剂量依赖效应。

图2 GLA引发DU145细胞G2/M期阻滞Fig.2 GLA induces G2/M cell cycle arrest in DU145 cells

2.3 GLA调节DU145细胞周期蛋白的表达1 μg/ml GLA刺激培养细胞24 h，与对照组相比，p21、cy‐clinB1、CDK1 mRNA与蛋白的表达均无统计学差异。但随着浓度的增加，2.5 μg/ml GLA能够促进p21的表达，并抑制cyclinB1与CDK1的表达；5 μg/ml GLA的作用效果更为明显，在显著促进p21表达的同时，更加抑制了cyclinB1与CDK1的表达，且qRTPCR与Western blot的结果基本一致，见图3。可见GLA调节DU145细胞周期相关因子的表达，在mRNA与蛋白水平上均表现出剂量效应。

图3 GLA调节DU145细胞周期相关蛋白的表达Fig.3 GLA regulate cell cycle relative protein expression in DU145 cells

图5 GLA促进DU145细胞凋亡Fig.5 GLA promote DU145 cells apoptosis

2.4 免疫荧光验证DU145细胞周期蛋白的定位表达免疫荧光结果进一步验证了Western blot的结果，细胞周期蛋白cyclinB1、CDK1主要表达于细胞质，5 μg/ml GLA能够显著抑制cyclinB1、CDK1的表达（见图4）。GLA引起DU145细胞周期阻滞与其抑制cyclinB1、CDK1表达的作用效果及剂量效应完全一致，因此推测GLA极有可能通过抑制cyclinB1、CDK1的表达而导致细胞周期阻滞于G2/M期。

图4 DU145细胞周期蛋白细胞内表达（×400）Fig.4 Localization of cell cycle relative protein in DU145 cells（×400）

2.5 GLA诱导DU145细胞凋亡GLA阻滞细胞周期后极有可能引发细胞生物学行为发生变化。流式检测结果显示：2.5 μg/ml GLA作用于细胞，虽然能引起凋亡增加，但与对照组相比并无统计学差异（P>0.05），5 μg/ml GLA才显 示 出促 凋 亡 效 果（P<0.01）。

3 讨论

前列腺癌为常见恶性肿瘤，近年来随着经济水平的不断提高，人口老龄化进一步明显，我国前列腺癌患者呈逐年上升趋势［5-6］。大多数前列腺癌发病隐匿、进程缓慢，就诊时往往已是中晚期，临床多用雄激素治疗，但很多患者治疗后期出现激素不敏感或耐受，最终肿瘤转移扩散［7］。因此迫切需要寻找抗肿瘤效果明确但不良反应少的药物。

传统中草药一直以其活性强、毒性小备受关注，其中香茶菜在民间应用历史悠久［1-4］，已用于临床的冬凌草就是从香茶菜中提取的活性成分，本研究选取的GLA则是香茶菜的另一种活性成分。前期研究发现，小剂量GLA能够通过IL-6激活Stat3信号通路，调节细胞炎症反应，促进肿瘤细胞增殖与侵袭迁移［8-9］。中草药往往对细胞功能具有双向调节作用，研究也表明GLA具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等作用［3-4］。因此，本研究采用较高浓度GLA作用于前列腺癌DU145细胞，探讨GLA抗肿瘤的作用机制。

增殖实验结果显示，2.5、5 μg/ml GLA作用于DU145细胞24 h后，可以抑制DU145细胞的增殖，尤以5 μg/ml GLA的作用效果更为显著。与前期实验结果一致的是，与对照组相比，1 μg/ml GLA对细胞增殖的影响作用并无统计学意义。这些结果均提示GLA抑制细胞增殖的作用呈剂量效应及时间依赖性。增殖与细胞周期关系密切，周期紊乱可以引起增殖异常。

细胞周期结果显示，与对照组相比，1 μg/ml GLA对细胞周期基本无影响。随着浓度增加，2.5 μg/ml GLA表现出阻滞作用，5 μg/ml GLA的阻滞作用尤为显著，G2期细胞达44.3%，整体上凸显G2/M期阻滞。G1期到S期、G2期到M期是复杂活跃的分子水平变化时期，容易受环境条件影响。已有研究发现，白藜芦醇能够抑制DU145细胞从G0/G1期向S期转变，从而抑制其增殖［10］。本研究结果提示GLA能够显著影响DU145细胞从G2期向M期的转变，进而阻滞细胞周期，抑制其增殖。

参与细胞周期调控的蛋白主要有S、M、G1期蛋白与CDK激酶。cyclin B为M期周期蛋白，从S期开始表达，在G2/M期到达峰值，后期消失。CDK1的活化依赖于cyclinB1，cyclinB1与CDK1结合并激活CDK1可以促进细胞由G2期进入M期［11］。p21则是CDK激酶的抑制剂，能够抑制cyclinB1/CDK的激活，阻滞细胞G2/M期转变［12］。鉴于GLA引发G2/M期阻滞，因此本研究进一步对p21、cyclinB1、CDK1进行检测。结果显示，5 μg/ml GLA作用DU145细胞24 h，促进p21表达的同时，显著抑制cyclinB1、CDK1的 表 达。GLA对p21与cyclinB1/CDK1的 作用效果正好相反。与此一致的是，LIN等［13］研究发现，GLA能够通过促进/抑制p21、Cdc25C等周期蛋白的表达，阻滞膀胱癌UMUC3的细胞周期。免疫荧光进一步印证了Western blot结果。与对照组相比，5 μg/ml GLA刺激培养24 h，DU145细胞质中cyclinB1与CDK1的表达明显增多。因此GLA极有可能通过抑制周期蛋白cyclinB1的表达，影响CDK1激酶的活化，进而导致G2/M期阻滞。

细胞周期紊乱会诱发凋亡，细胞周期长时间停滞也会诱发凋亡。流式结果就显示出5 μg/ml GLA能够引起DU145细胞凋亡，提示GLA引起周期阻滞的同时，也诱发了凋亡。已有研究发现，GLA能够抑制PI3K/Akt信号通路，导致p21、Bax蛋白累积，继而激活下游信号通路，引起细胞周期阻滞和凋亡［13-15］。本研究结果也显示GLA诱发G2/M期阻滞与p21蛋白增多相关，提示GLA极有可能通过p21蛋白信号通路诱导DU145细胞凋亡，具体作用机制在后续实验中进一步探索。

综上所述，本研究发现GLA能够诱导DU145细胞周期阻滞于G2/M期，这一作用极有可能是通过抑制细胞周期蛋白cyclinB1、CDK1的表达而诱发，cyclinB1、CDK1表达升高进一步激活凋亡信号通路，促进细胞凋亡。因而，控制GLA的作用浓度及作用时间，有效发挥其阻滞细胞周期的作用，对前列腺癌防治有新的意义和价值。