Ku70正向调控cGAS介导的天然免疫反应①

储贝 孙钦秒（中国科学技术大学生命科学学院，合肥230027）

天然免疫系统作为机体抵御病原体入侵的第一道防线，在识别病原体和激发适应性免疫保护中发挥重要作用［1］。其免疫识别的分子机制是机体通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别病原体相关分子模式（pathogen associat‐ed molecular patterns，PAMPs）以及近年提出的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活下游信号通路，产生促炎症因子和干扰素，引发固有免疫应答［2-6］。其中，PAMPs是指由病原菌（如LPS）或病毒（如dsRNA/ssRNA/dsDNA/ssDNA）释放的分子，而DAMPs是指由受损或死亡细胞释放的内源性分子，如ATP、尿酸晶体及S100蛋白［7］。

目前，已知的PRRs包括膜结合的Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素受体（C-typ‐electin receptors，CLRs）；胞质中的RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs）、NOD样受体（NODlike receptors，NLRs）及DNA感 受 器（DNA-depen‐dent activator of IRFs，DAI）等［8-9］。随着PRRs研究深入，研究者对于其参加抗病毒应答分子机制的认识也更为深刻。

cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）作为一种重要的胞质DNA识别受体，广泛存在于哺乳动物各种从细胞。当cGAS识别内源或外源的非正常DNA后，自身激活，并将ATP和GTP催化合成cGAMP［10-13］。游离的第二信使分子cGAMP与定位于内质网的受体 蛋 白STING（stimulator of interferon genes）结合［14-15］。激活的STING构象发生改变，形成二聚体并招募下游TBK1激酶（TANK binding kinase 1）、NIK（NF-κB inducing kinase）和异三聚体IKK蛋白，形成庞大的信号复合物。其中，TBK1磷酸化下游IRF3（interferon regulatory factor 3）使其形成磷酸化二聚体，转位进入核内，产生大量Ⅰ型干扰素，激活STING/TBK1/IRF3信号通路，触发抗病毒反应［16-17］。

DNA依赖性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）是一种主要定位于核内的Ser/Thr激酶［18-19］。DNA-PK是异源三聚体蛋白复合体，由异源二聚体Ku蛋白和1个约460 kD的催化亚基DNAPKcs共同组成。其 中，Ku蛋 白由70 kD的Ku70蛋白和80 kD的Ku80蛋白构成，该复合体蛋白在部分生物学过程中发挥关键作用，如固有免疫应答、非同源末端连接（NHEJ）、V（D）J重组、细胞凋亡、端粒维持与细胞衰老、DNA复制等［20-21］。

DNA-PK作为重要的胞质DNA受体，在抗病毒固有免疫反应中也发挥关键作用。研究发现，激光扫描共聚焦显微镜观察HEK293T细胞，内源Ku70蛋白定位于细胞核，DNA刺激时，Ku70出核靶定于胞质并与STING形成复合体，促进固有免疫应答反应［22］。敲低HEK293细胞中Ku70蛋白可有效抑制DNA诱导的IFN-λ1激活［23］。此外，成纤维细胞中，DNA-PK作为胞质受体，识别并结合牛痘病毒DNA，诱导产生Ⅰ型干扰素，引发机体下游免疫反应［24］。但DNA-PK是否参与cGAS/STING/TBK1/IRF3信号通路和具体调控机制尚未明确。

因此，本研究通过免疫共沉淀与质谱技术筛选得到与cGAS结合的Ku70蛋白，通过蛋白互作实验检测两者是否存在相互作用。同时，在HEK293T细胞中过表达Ku70，利用荧光素酶报告基因实验探究Ku70是否参与cGAS介导的信号通路。敲低THP-1细胞中Ku70表达，利用Western blot和qPCR技术探究Ku70对cGAS-STING信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系人源HEK293T、THP-1细胞购自中科院上海细胞库，储存于液氮罐。参考ATCC数据库，HEK293T培养于DMEM基础培养基，THP-1细胞培养于RPMI1640基础培养基，加入适量胎牛血清及双抗。

1.1.2 主要试剂基础培养基和双抗溶液购自Gibco公司；胎牛血清购自Hyclone公司；转染试剂Lipofectamine2000和OPTIMAL-MEM购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自ABM公司；SYBR Green染料购自康为公司；显影发光底物购自Thermo Fisher；Herring testis DNA（HT-DNA）购自Sigma；分析化学试剂（乙醇、甲醇、异丙醇等）购自北京化工公司。实验中所用DNA病毒为HSV-1（Ⅰ型单纯疱疹病毒），Vero细胞扩增。

1.2 方法

1.2.1 细胞传代超净台中弃原有培养基，1×PBS洗去残留培养基，缓慢加入预热胰酶，轻轻摇晃培养皿，置于培养箱1~2 min，轻轻拍打培养皿使细胞分散，加入新鲜培养基终止消化。收取细胞，离心，按适当传代密度转移细胞悬液至预先加有新鲜培养基的培养皿，均匀分布于培养皿，移至37℃细胞培养箱，完成细胞传代工作。悬浮生长的细胞可直接收取细胞进行传代，无需胰酶消化。

1.2.2 细胞转染及敲低细胞系构建采用PEI、Li‐pofectamine2000转染细胞，Lipofectamine2000转 染按说明书操作。采用PEI在HEK293T细胞中过表达外源目的基因时，需保证细胞密度为70%~80%。取1个1.5 ml EP管加入Opti-MEM及目标质粒，另取1个1.5 ml EP管加入Opti-MEM，按质粒与PEI质量体积比为1∶2加入PEI，混匀2个EP管中液体，静置8~10 min。将转染液缓慢加入培养皿中，放回培养箱。PEI毒性较高，转染后6~8 h需及时更换新鲜培养液。24~48 h后收取细胞，完成后续实验。

采用RNA干扰技术沉默靶基因Ku70表达。设计针对Ku70基因的短发卡shRNA（靶向核酸序列：GAAGAGTCTACCCGACATAAG），通过慢病毒包装的形式将shRNA转入THP-1细胞。由于Plko.1载体中U6启动子可保证shRNA长时程表达，从而筛选出Ku70敲低的THP-1稳定细胞系。

1.2.3 Western blot弃细胞培养基，1×PBS清洗细胞。根据细胞量加入SDS loading buffer直接裂解细胞，98℃煮沸。将制备好的蛋白样品进行电泳、转膜、封闭，孵育盒中孵育一抗2 h。若目标蛋白为内源蛋白，则4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入相应鼠或兔二抗，继续孵育1 h，TBST清洗3次，参照显影试剂盒说明书配制显影发光底物，置于底物溶液中孵育30 s，显影仪下选择合适曝光次数与时间扫描拍照。

1.2.4 免疫共沉淀采用6 cm培养皿进行HEK293T细胞内质粒转染，过表达特定蛋白，研究蛋白相互作用。转染24~48 h后收取细胞，并用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液裂解细胞，离心，取少量上清转至新的EP管，加入SDS loading buffer，煮样，作为Input样品，检测过表达蛋白表达。同时，将剩余上清转至装有活化beads的EP管，4℃旋转混合仪内缓慢摇晃，孵育4~6 h或过夜。清洗3~4次，加入loading buffer，煮样，作为IP样品。Input和IP样品进行后续Western blot实验。

1.2.5 荧光素酶报告基因实验24孔板中HEK293T细胞密度达60%~70%时，转染一定量Re‐nilla、pGL3-IFN-β-luciferase或pGL3-ISRE-luciferase等质粒［25］。转染24 h后，弃培养基，100 μl/孔加入裂解液，冰上裂解细胞10 min，离心，取20 μl上清依次加至干净的96孔板，每孔定量加入50 μl Lucifer‐ase assay substrate，轻轻混匀液体，酶标仪测量荧光活性，以Renilla为内参，分析数据。

1.2.6 qRT-PCR根据RNA抽提试剂Trizol说明书提取THP-1细胞总RNA，Nanodrop2000测定RNA浓度。取2 μg RNA，参照Abm公司逆转录试剂盒，常规PCR进行cDNA合成反应。将反转得到的cDNA与反应液加至96孔板，Bio-Rad Q-PCR仪中进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism软件进行统计学分析，t检验分析差异显著性，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达Ku70与cGAS存在相互作用

HEK293T细 胞 中PEI转 染HA-cGAS、HA-STING、Flag-Ku70质粒24 h，免疫共沉淀技术及Western blot分析蛋白相互作用，结果表明，HEK293T细胞中，外源过表达的Ku70蛋白和cGAS蛋白存在较强的相互作用，相反，STING蛋白与Ku70蛋白不存在相互作用（图1）。

图1 过表达Ku70与cGAS相互作用Fig.1 Overexpression of Ku70 interacts with cGAS

2.2 Ku70正向调控cGAS信号途径体外实验结果显示，Ku70与cGAS有较强的相互作用，提示Ku70蛋白可能参与cGAS介导的抗DNA病毒天然免疫信号途径。荧光素酶报告实验结果显示，HEK293T-STING-stable细胞中，cGAS表达显著激活IFN-β表达，而Ku70与cGAS共表达显著增强cGAS诱导的激活反应，且呈剂量依赖性，提示Ku70正向调控cGAS活性，促进cGAS诱导的Ⅰ型干扰素表达（图2）。

图2 过表达Ku70促进cGAS诱导的Ⅰ型干扰素表达Fig.2 Overexpression of Ku70 enhances cGAS-mediated typeⅠinterferon expression

2.3 Ku70不参与STING介导的信号途径探究Ku70是否影响下游接头蛋白STING活性，在HEK293T细胞中瞬时转染ISRE报告基因，结果显示，缺少STING的HEK293T细胞几乎不表达ISRE，过表达STING显著激活ISRE表达；Ku70或Ku70与STING共表达时，对STING诱导的ISRE激活无显著影响，且无剂量依赖关系，提示Ku70主要调节STING上游信号转导（图3）。

图3 Ku70过表达对STING介导的信号途径的影响Fig.3 Effect of Ku70 overexpression on STING-mediated signaling pathway

2.4 敲低Ku70抑制DNA病毒诱导的IFN-β产生基于cGAS在宿主抵抗DNA免疫应答中的关键作用，探究Ku70是否影响HSV-1病毒及HT-DNA诱导的天然免疫信号转导途径。qPCR数据显示，shRNA有效降低THP-1细胞中内源Ku70表达，靶向沉默序列有效。同时，Ku70敲低的THP-1细胞应对HSV-1感染和HT-DNA刺激时，与野生型细胞相比，其诱导的内源性IFNB1 mRNA含量明显降低，表明敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫应答（图4）。

图4 敲低Ku70抑制宿主抗DNA病毒免疫应答Fig.4 Knockdown Ku70 inhibits host immune response against DNA viruses

2.5 干扰Ku70表达抑制Ⅰ型干扰素信号通路活化Ku70敲低的稳定THP-1细胞系中，HT-DNA作为刺激物分别处理Plko.1和shKu70细胞，Western blot结果表明，HT-DNA刺激后，shKu70细胞中下游P-IRF3表达明显降低，提示Ku70正向调控宿主抗DNA病毒天然免疫信号通路（图5）。

图5 降低Ku70表达下调HT-DNA诱导的IRF3磷酸化水平Fig.5 Ku70 silencing down-regulates phosphorylation levels of IRF3 induced by HT-DNA treatment

3 讨论

cGAS是一种重要的胞质DNA识别受体，在抵御外界病原微生物及自身DNA引起的固有免疫应答中起重要作用［16，27］。但cGAS抗病毒天然免疫调控机制仍需进一步研究。本研究发现，同样作为胞质受体分子的Ku70蛋白与cGAS蛋白存在相互作用，并通过促进Ⅰ型干扰素产生正向调控cGAS介导的抗DNA病毒天然免疫反应。根据已有研究报道，当识别病毒DNA后，活化的cGAS催化合成cGAMP，激活STING蛋白，进而触发cGAS/STING/TBK1/IRF3信号通路，产生Ⅰ型干扰素的抗病毒反应，其中，cGAS识别并结合DNA是其发挥酶活性、激活下游通路所必需的［28］。Ku70能否作为“辅助者”通过促进cGAS有效识别并结合胞质或病毒DNA，进而增强cGAS酶活，最终发挥正向调控功能。与此同时，作为异源三聚体蛋白复合体，DNAPK中另外两个成员（DNA-PKcs、Ku80）是否共同参与Ku70调控cGAS介导的抗病毒免疫应答？彼此间是否存在相互促进或竞争关系？实验证明Ku70与cGAS存在较强的相互作用，这种相互作用是直接作用还是通过某个支架分子介导间接作用？针对以上问题，鉴于DNA感受通路影响多个生理过程和多种疾病，课题组将继续深入探寻Ku70在cGAS介导的固有免疫信号通路中的精细调控机制，为机体抵御病原体入侵及相关疾病发生提供线索及潜在靶标。

近年关于cGAS的研究范围越来越广，也让研究者充分认识到事物的多面性。除参与固有免疫应答，Ku70还参与调控非同源末端连接（NHEJ）、细胞凋亡、端粒维持与细胞衰老等［29-30］。与之相对应的cGAS也参与调控细胞周期与细胞衰老，在核内抑制同源重组介导的修复［31-32］。以上生物学事件中，Ku70与cGAS或许也存在某种特殊的调控关系，仍需进一步研究。