221例初筛RhD阴性个体中D变异型分析

聂婷婷，杨 帆，韩 瑜，于江虹，刘玲玲，焦立新

(吉林省血液中心，吉林 长春130033)

在Rh血型系统抗原中，发现D抗原免疫原性最强[1]。RhD抗原不合的输血或妊娠等可以产生Rh抗体并导致溶血性输血反应和新生儿溶血病[2-3]。根据红细胞膜上RhD抗原的数量不同以及抗原结构发生变化使RhD抗原有多种变异型，包括弱D(Weak D)、部分D(Partial D)及D放散型(Del)。由于RhD变异型血清学表达的差异不明显，在血清学中难以准确区分，一般需要结合分子生物学方法进行RHD基因鉴别[4-5]。本研究应用荧光PCR方法与血清学共同检测，避免可能出现的误判。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2020年7月-2020年12月期间在本血液中心献血的志愿者，采用单克隆抗体IgM-D试剂经PK7300全自动血型分析仪初筛为RhD阴性血液样本共221例。

1.2 仪器与试剂

全自动血型分析仪(贝克曼PK7300，美国)；荧光定量PCR仪(ABI 7500，美国)；人类红细胞RHD基因分型检测试剂盒(江苏伟禾生物科技有限公司)；样本释放剂试剂盒(广州展全生物科技有限公司)；微柱凝胶抗人球卡(珠海贝索生物技术有限公司)；单克隆抗体IgG抗-D试剂、单克隆抗体IgM抗-D试剂、抗人球蛋白试剂(上海血液生物医药有限责任公司)。

1.3 方法

1.3.1RhD阴性的血型血清学确认 采用间接抗人球蛋白试验(IAT)进行RhD阴性确认并鉴定弱D型[6]。

1.3.2Del型的血型血清学检测 上述实验RhD阴性样本继续进行吸收放散实验。实验中设置阴、阳性对照，采用0.9%生理盐水洗涤红细胞3次，以2 500 r/min离心2 min，取200 μl待检压积红细胞与200 μl的IgG抗-D单克隆抗体在37℃水浴箱中，温育1 h，期间每隔20 min摇晃一次。0.9%生理盐水洗涤红细胞6次，留取末次上清作为对照。取压积红细胞200 μl与酸释放液1∶1混合，吸管吹打3次，3 500 r/min离心3 min，吸取上清的放散液至新的试管中，加入3-5滴中和液至溶液变为蓝紫色后再次离心，3 500 r/min 3 min取上清100 μl，加入微柱凝胶卡孔中，每孔中还需加入1%的RhD阳性红细胞悬液50 μl，37℃孵育15 min，卡式专用离心机离心10 min，判读结果:凝集为阳性(Del型)。

1.3.3荧光PCR 检测RHD基因型 提取经吸收放散确定的Del型样本的基因组DNA，根据伟禾生物公司提供的试剂盒如下：灭菌水12.6 μl/孔，B2主反应液3 μl/孔，E2酶混合液0.4 μl/孔，DNA浓度要求在15-40 ng/μL。PCR扩增条件:95℃ 2 min 30 s，1个循环；94℃15 s、65℃ 55 s、共35个循环，反应终止。根据反应曲线，结合试剂盒提供的结果判读表确定基因型，见表1。

表1 荧光PCR结果判读表

1.4 RHD基因变异型验证随机抽取荧光PCR检测出的RHD基因变异型6例，包括：Del 1227AA纯合型3例、Del 1227GA杂合型1例、弱D15型2例，进行RHD基因10个外显子序列分析，验证荧光PCR方法检测的正确性。

2 结果

2.1 血型血清学实验结果221例初筛RhD阴性样本经RhD阴性确认及Del型检测，发现RhD变异型46例，包括：弱D型12例、Del型34例，另外175例样本为RhD阴性(见表2)。

表2 初筛RhD阴性样本血清学检测结果(n=221)

2.2 荧光PCR方法结果46例RhD变异型样本经荧光PCR方法检测到Del 1227A纯合型33例，Del 1227GA杂合型1例，弱D15型G282D 12例(见表3)。

表3 46例RhD血清学变异样本基因检测结果

2.3 RHD基因变异型验证结果RHD基因10个外显子区序列分析证实：3例Del 1227AA型个体碱基序列在1227位是A和A的纯合子，1例Del 1227GA型个体在1227位是A和G的杂合子，2例弱D15型个体碱基序列在845位是G和A杂合子。基因测序结果与荧光PCR方法结果一致。

3 讨论

RhD血型系统中，RhD抗原在临床输血方面有着重要的意义。因RhD存在差异的表达情况，即为弱D、部分D以及Del型。弱D抗原为RHD基因错义性突变，导致细胞膜上或细胞膜内部分氨基酸改变造成，现被报道已超过40种。部分D的分子基础是RHD基因与RHCE基因之间的碱基交换，形成多处突变，但RHD基因的正常阅读框架不变。Del则是D抗原数量少与结构发生改变，只能通过吸收放散方法检测出。由于现存在抗D血清试剂的局限性，以及吸收放散实验不作为常规检查方法，使医院输血科以及血站进行常规RhD阴性血型血清学确认时，存在漏检现象，误将表达较弱的弱D以及Del血样鉴定为阴性血。为降低临床输血风险，则有必要结合分子生物学方法准确鉴定其基因型，分析分子背景。

本研究提示长春地区初筛RhD阴性的人群中存在一定比例的D变异型，其中大多数为Del型个体,且均携带1227G>A 等位基因；其次为弱D15型G282D[RhD(845G>A)/d]型。这与其他研究的结果相一致：中国人汉族人群中Del和弱 D15 型是最常见的D变异型[7-8]，但是本研究未发现另外一种常见的D变异型DVI，今后需要扩大样本量进一步研究。在临床输血方面，具有RHD*1227基因的Del型个体红细胞，也会引起免疫回忆反应[9]；但携带有RHD*1227A等位基因的孕产妇，却可以不用接受定期的抗体效价的检测及抗D免疫球蛋白的治疗[10]；去除Del，已报道的中国人群D变异型主要是弱D15型，此种个体RhD抗原表位缺失，在D阳性完全抗原的刺激下，可产生同种抗D抗体[11]，所以现阶段受血者均作为D阴性对待。

目前常用的RHD基因检测方法有PCR-SSP、高分辨率溶解曲线技术。因PCR-SSP方法需要电泳步骤，耗时长，且存在假阴性、假阳性；高分辨率溶解曲线技术对设备要求高，使以上两种方法应用存在困难。本研究采用荧光PCR方法，结合血清学技术实现快速、准确鉴定常见RhD变异型，可以有效减少工作量，并保证临床输血安全。