枯草芽孢杆菌蛋白酶结构与表达载体分析

张荣宗，江丁文，陈锦香

（1.惠安县乡镇畜牧兽医站，福建 泉州 362100；2.惠安县螺城镇经济发展服务中心，福建 泉州 362100）

枯草芽孢杆菌能分泌多种酶，具有多种功能，能够促进肠道消化、体表消毒、消灭蚊虫蜱蚤和寄生物、降解养殖水体有机质、适应高温密闭环境、有较强的免疫原性、抑制有毒有害物质生成和减少面源污染等；大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物、线虫动物等生物细胞可以作为克隆、重组杂交、突变基因、转基因的表达载体，它们的基因密码子表达上存在偏好性，一般蛋白酶基因密码子表达也存在偏好性[1-13]。本文拟分析枯草芽孢杆菌蛋白酶结构，并比较其基因密码子和生物细胞载体基因密码子偏好性，以便选择合适的宿主表达系统；所引用的序列数据为公开数据，用以了解与动物生产科学、种质资源和产品质量、病虫鼠害预测预报、蚕丝和毛皮净化、化学消毒和菌虫残留、良种基因细胞和胚胎保护、小微动物药用和疗养、动植物细胞培养肉、动物饮水饲料饲草和食果食蔬、动物屠宰加工、畜牧养殖设施保养、抗菌喷淋安全防护、生理生长发育、色素发酵、营养代谢、生态平衡、无害化处理和污染控制等有关的生物细胞表达，不负责侵权责任，其中选取的编码基因为成熟肽的枯草芽孢杆菌蛋白酶基因。

1 枯草芽孢杆菌蛋白酶结构预测

根据SWISS-MODEL的同源建模（homology modeling），对成熟肽的枯草芽孢杆菌蛋白酶氨基酸序列进行三维空间结构预测，结果如图1所示。根据同源模型结果，模型和模板的序列同源性为98.91%，GMQE评估值为0.94，属于可靠的模型[20]。

图1 枯草芽孢杆菌蛋白酶预测模型Fig.1 Bacillus subtilisprotease prediction model

根据SAVES服务器的PROCHECK检测，对蛋白质的三维结构预测结果的质量进行检查，结果如图2所示。图中通过分析氨基酸残基二面角ψ（psi）和φ（phi）是否分布在合理区域，揭示蛋白质三维结构预测模型的准确性。由图2可知，枯草芽孢杆菌蛋白酶三维结构预测模型100%氨基酸残基落在允许区，其中90.3%落在最适区，9.7%落在附加区，没有落在宽容区，这表明预测的结构模型准确度高，符合立体化学几何结构，具有较高的合理性，超过90%氨基酸残基落在最适区，属于高质量的预测模型[14]。

图2 枯草芽孢杆菌蛋白酶氨基酸残基二面角分布Fig.2 Dihedral angledistribution of amino acid residues of Bacillus subtilis protease

RaptorX property在线预测成熟肽的枯草芽孢杆菌蛋白酶二级结构结果表明，按照3类结构划分，枯草芽孢杆菌蛋白酶含有7个α-螺旋（H）结构，由70个氨基酸组成；9个β-折叠（E）结构，由35个氨基酸组成；17个不规则卷曲（C）结构，由170个氨基酸组成。按照8类结构划分，枯草芽孢杆菌蛋白酶含有7个α-螺旋（H）结构，由73个氨基酸组成；3个310-螺旋（G）结构，由8个氨基酸组成；10个β-折叠（E）结构，由49个氨基酸组成；2个β-桥（B）结构，由2个氨基酸组成；19个β-转角（T）结构，由39个氨基酸组成；14个高度弯曲环（S）结构，由19个氨基酸组成；34个不规则（L）结构，由85个氨基酸组成。这说明，枯草芽孢杆菌蛋白酶主要结构是α-螺旋和不规则结构[15-20]。

2 编码基因密码子与生物载体基因比较分析

密码子使用频率（Codon Usage，CUSP）是指编码基因密码子的使用频率。在进行基因宿主细胞表达时，要使表达基因与宿主细胞的密码子用法尽可能一致，以提高表达效率。目前常用的表达载体有大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞、线虫动物细胞等，大肠杆菌发酵底物和毕赤酵母碳源分别有糖类、甲醇等，枯草芽孢杆菌的表达系统安全、表达量高，昆虫细胞表达系统常用杆状病毒感染昆虫细胞，哺乳动物细胞和线虫动物细胞表达系统主要用病毒颗粒感染宿主细胞和显微注射法等非病毒载体的方式将基因导入到细胞中，经过成功转化的重组菌可能更为安全有效[21-22]。

根据genebank（登录号：MK673996.1）的芽孢杆菌蛋白酶编码基因序列，比较了其成熟编码基因密码子与候选生物载体基因组密码子使用偏性，选择合适的生物细胞表达系统。由表1可知，枯草芽孢杆菌密码子使用频率与黑腹果蝇细胞基因组相比，使用偏性差异较大的有30个；与黑线仓鼠CHO细胞基因组相比，使用偏性差异较大的有29个；与大肠杆菌基因组相比，使用偏性差异较大的有23个；与巴斯德毕赤酵母基因组相比，使用偏性差异较大的有19个。据此说明，枯草芽孢杆菌蛋白酶基因与黑腹果蝇细胞基因组密码子使用偏性差异最大，而与巴斯德毕赤酵母基因组密码子使用偏性差异最小，巴斯德毕赤酵母是枯草芽孢杆菌蛋白酶最适合的表达载体。

表1 枯草芽孢杆菌蛋白酶编码基因与生物载体基因比较Tab.1 Comparison of Bacillus subtilis protease coding genes and biological carrier genes

3 结论

在基因表达中选择合适的细胞表达载体系统，将有助于基因高效准确表达，进而提高表达的整体质量。经过对枯草芽孢杆菌蛋白酶同源建模的三维预测模型检测，发现该模型超过90%氨基酸残基落在最适区，属于高质量的预测模型，枯草芽孢杆菌蛋白酶主要结构是α-螺旋和不规则结构；对枯草芽孢杆菌蛋白酶基因与候选生物载体细胞基因组进行比较，发现枯草芽孢杆菌密码子使用频率与黑腹果蝇细胞基因组相比，使用偏性差异较大的有30个，差异最大；与巴斯德毕赤酵母基因组相比，使用偏性差异较大的有19个，差异最小；与其他细胞基因组相比，使用偏性差异居中。这表明，巴斯德毕赤酵母是枯草芽孢杆菌蛋白酶最适合的表达载体。