鱼类白细胞介素-1β研究进展

李庆伟， 宋晓萌， 逄 越

(1.辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081；2.辽宁师范大学 七鳃鳗研究中心，辽宁 大连 116081)

白细胞介素-1(Interleukin-1, IL-1)家族及其相应受体是介导炎症反应的主要信号分子.IL-1家族成员是一类细胞因子，通过连接先天和后天免疫系统启动炎症级联反应[1].在哺乳动物中已经发现了11个IL-1家族成员[2-3]，根据其共有序列，可分为3个亚家族：具有促炎活性的分子(IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36α, IL-36β和IL-36γ)、天然受体拮抗剂(IL-1Ra, IL-36Ra和IL-38)和抗炎细胞因子(IL-37)[4].

目前，在鱼类中仅发现2个IL-1家族成员：IL-1β和IL-18[5].IL-1β作为一种有效的促炎细胞因子，在哺乳动物机体免疫调控中发挥着重要作用[6]，是IL-1家族中研究最多的成员.随着对IL-1β研究的不断深入，目前已克隆得到多种鱼类的IL-1β基因，并利用多种生物学技术对鱼类IL-1β的组织表达及功能展开研究.本文从IL-1β的进化、结构、在各组织中分布情况以及生物学功能等方面进行总结，以期为了解鱼类IL-1β的结构和功能奠定理论基础.

1 IL-1β的进化研究

IL-1β最初在人类(Homosapiens)和小鼠(Musmusculus)中被发现，目前的研究已经证实该分子不仅在哺乳动物中存在，还在鸡(Gallusgallus)[7]、中华鳖(Pelodiscussinensis)[8]、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)[9]等非哺乳动物中存在.1999年，Zou等人采用同源克隆的方法，最早从虹鳟(Oncorhynchusmykiss)中克隆得到IL-1β基因序列[10].到目前为止，已在多种鱼类中鉴定出了IL-1β基因，包括虹鳟、草鱼(Ctenopharynogodoniddla)[11]、斑点猫鲨(Scyliorhinuscanicula)[12]、鮸鱼(Miichthysmiiuy)[13]、海参斑鱼(Cyclopteruslumpus)[14]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[15-16]、海鲈(Dicentrarchuslabrax)[17]、斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)[18]、太平洋鳕鱼(Gadusmacrocephalus)[19]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[20]和牙鲆(Paralichthysolivaceus)[21-22]等.

在一些物种中存在一个以上IL-1β基因[15,22].最新的研究表明，在新真骨鱼亚群(Neoteleostei)、原棘鳍总目(Protacanthopterygii)以及更高等的鱼类中存在两种不同的IL-1β[14-16,21-26].同一物种的两种IL-1β基因具有很高的序列一致性，并被认为可能是在特定鱼类谱系(如虹鳟鱼和鲤鱼)或在串联基因复制后(如鲶鱼)发生的进一步基因组复制事件的结果[15].通过对基因结构和共线性基因分析比较，将硬骨鱼中编码IL-1β的基因分为两种类型：Ⅰ型(IL-1β2)和Ⅱ型(IL-1β1)[14,24].

在高等脊椎动物中，IL-1β的侧翼基因较为保守.对不同脊椎动物IL-1β基因的共线性分析显示，鱼类IL-1β的连锁基因与四足动物相比存在较大差异.这一研究表明，基因在染色体上的定位可能与生活条件的变化有关，其中，水环境被认为是影响脊椎动物进化的重要因素[27].CKAP2L是人类和硬骨鱼IL-1β基因座之间唯一的共同基因，与硬骨鱼IL-1β1基因紧密连锁，但在硬骨鱼IL-1β2基因座中缺失[24].对于大多数脊椎动物而言，CKAP2L基因位置邻近IL-1β基因，这暗示着该基因座可能出现在大约3.1亿a前——鸟类和哺乳动物的分化之前[7,13].IL-1β1和IL-1β2基因座之间也存在一定的相似性，例如：与CNNM4和PURB基因的接近度，这表明硬骨鱼IL-1β基因是人类IL-1β的直系同源基因，且两种类型的IL-1β可能起源于硬骨鱼特异性的第三轮全基因组复制(3R WGD)[14,23].

人、小鼠和大鼠(Rattusnorvegicus)IL-1Ra、IL-1α和IL-1β基因具有相似的“7外显子-6内含子”结构，这表明基因复制事件可能促进了IL-1家族的产生过程[28-30].Gibson等人指出，在物种形成之前，在其共同祖先中已经形成了IL-1家族.当单个物种面临一系列不同的挑战时，这些基因可能受到了显著的选择性压力，从而导致它们在基因组中的分散[7].人类第7号染色体上存在一个包含非哺乳动物IL-1β两侧大部分基因的基因座，这与Gibson等人关于IL-1配体基因的进化的观点相一致.

对于IL-1Ra、IL-1α和IL-1β三者的进化起源关系，目前存在两种假设：一是IL-1Ra由祖先IL-1基因复制产生而来，对应于两栖动物出现的时间(3.2～4.0亿a前)，而IL-1α和IL-1β的分离则被认为是最近发生的(2.7～3.0亿a前)[28]；二是IL-1α首先从祖先IL-1中复制出来，与IL-1Ra和IL-1β的之间的差异相比，IL-1α与这两种蛋白质的差异更大.由此推论，IL-1β和IL-1Ra的共同祖先是一个选择性剪接的基因，该基因产生的一个转录本编码了祖先IL-1β，而另一个转录本编码IL-1Ra.当基因复制事件发生后，产生了编码不同产物的两个基因[28,31].近年来，在软骨鱼等古老的脊椎动物物种中陆续发现了IL-1β基因，可以肯定的是，IL-1β的起源很早.

2 鱼类IL-1β的结构

成熟的IL-1β蛋白质结构中存在12个β-片层，折叠形成对受体结合至关重要的三叶草状结构[32].IL-1β的C-末端保守区域存在一个IL-1家族特征基序：[FC]-xS-[ASLV]-x(2)-Px(2)-[FYLIV]-[LI]-[SCA]-Tx(7)-[LIVM][28](图1)，该序列跨越IL-1β成熟体的第9～11个β-折叠[23].鸡[7]和非洲爪蟾[9]的IL-1β均具有该特征序列，但在硬骨鱼和软骨鱼中该特征序列出现细微差异[23].鱼类的两种IL-1β都具有IL-1家族的特征序列和β-三叶草结构.高等脊椎动物的IL-1β由IL1前体结构域和IL1结构域组成，其中,IL1结构域是保守存在的.而在部分鱼类和圆口纲物种中缺少IL1前体结构域.有研究指出，IL1前体结构域的功能重要性较低，其唯一作用是阻止与IL-1R1的结合[33]，这解释了不同物种间IL1前体结构域的同源性远低于IL1结构域的现象.与其他脊椎动物一样，鱼类的IL-1β缺乏信号肽，目前认为IL-1β通过非经典的分泌途径从细胞中释放出来[34].

在哺乳动物中，IL-1β以无活性的前体形式产生并存在于细胞质中，炎症小体激活可导致IL-1β成熟和分泌，以响应各种胞质危险信号[35-36].哺乳动物IL-1β前体经Caspase-1特异性切割第5个外显子中Asp116处的Asp-X键(X表示疏水残基)，形成具有生物学活性的成熟IL-1β[35].Caspase-1(ICE)识别位点在哺乳动物IL-1β序列中严格保守，在鱼类的相应区域(如虹鳟IL-1β的第4个外显子和海鲈IL-1β的第3个外显子)并未发现ICE酶切位点[37-39].

Reis等使用定点诱变技术确定了鸡IL-1β前体的ICE切割位点为Asp80，海鲈的切割位点为Asp100[40].在斑马鱼(Daniorerio)中，Caspase-1的两个同系物Caspase A/B具有3个切割位点Asp88、Asp104和Asp122[41]，其中,Asp122对应于海鲈的切割位点，这是存在于所有脊椎动物IL-1β序列的保守天冬氨酸残基.草鱼IL-1β前体在Asn91位置被切割为成熟的IL-1β[11]，对应斑马鱼的Asp88位置.Chen等人发现大菱鲆(Scophthalmusmaxixus)Caspase切割IL-1β发生在Asp86处[42](图1).

此外，IL-1β前体也可以被不同的胞外蛋白酶切割，如胶原酶、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、糜蛋白酶和颗粒酶A等[43-46].这一结果表明，尽管IL-1β裂解位点在不同物种中并不保守，但IL-1β的裂解在其发挥功能上是相对保守的，这有助于更好地了解硬骨鱼类的先天免疫.

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3 鱼类IL-1β的表达谱比较

通过同源克隆或借助细菌、脂多糖(LPS)等刺激以提高转录水平，目前已经在多种硬骨鱼和软骨鱼中发现并鉴定了IL-1β基因序列.

3.1 鱼类IL-1β的组织分布

在大多数硬骨鱼中，IL-1β分子呈现出多组织分布的特点[11,14,19-20,47-56].然而，不同鱼类的IL-1β具有不同的组织表达谱(表1).例如，草鱼、香鱼(Plecoglossusaltivelis)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)和重唇鱼(Hemibarbuslabeo)的IL-1β在脾、鳃和头肾中表达量较高[11,49-51]；而在黄鳍金枪鱼(Acanthopagruslatus)中，IL-1β在肾脏和脾脏中弱表达，在肝脏、肌肉和心脏中不表达[55].黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)的IL-1β则主要在体肾、血液和心脏中表达[53].在黄鳝(Monopterusalbus)中，IL-1β在肠、脾、肝和脑中有较强的表达，但在肌肉、头肾、血液和心脏中的表达量较少[47].

在一些鱼类中存在多拷贝的IL-1β基因，不同IL-1β亚型的表达组织存在一定的差异.在海参斑鱼中，IL-1β1的表达变化很大，在白细胞、头肾、皮肤黏液以及脾脏中转录水平较高，在性腺中最低.而IL-1β2在各组织的表达水平普遍较低，在肝脏中相对最高[14].斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)IL-1β1在肝脏、头肾、脾脏、肠和肌肉中大量表达，在胃、脑、卵巢、皮肤和体肾中表达量较低.而IL-1β2除了在脑中表达水平较低外，在其他所有受试组织中均匀表达[54].

尽管IL-1β基因在不同鱼类中的组织分布模式有所差异，但值得注意的是，鱼类IL-1β分子主要在头肾、脾脏等免疫相关组织以及鳃等黏膜免疫组织中高水平表达，这意味着IL-1β分子在鱼类免疫系统中具有重要意义.IL-1β在不同器官中的表达谱的差异可能与不同鱼种的免疫细胞系统不同有关，这有待进一步研究.

3.2 鱼类IL-1β的刺激应答反应

IL-1β是一种关键的炎症细胞因子，在宿主对病原体感染的免疫反应过程中扮演重要角色.先前的研究显示，在应对不同的病原体刺激时，鱼类IL-1β的表达模式变化呈现明显的差异(表1).

感染溶藻弧菌(V.alginolyticus)显著促进了大黄鱼各组织中IL-1β基因的转录，其中，头肾和鳃中的转录水平变化最为显著[20]；在感染耶尔森氏菌(Yersiniaruckeri)后，虹鳟脾脏中两种IL-1β的表达量增加数千倍[25]；嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的刺激作用能够引起黄鳝头肾和脾脏IL-1β大量表达[47]，提示IL-1β在抗菌反应中的重要作用.嗜水气单胞菌的刺激可使大鳍鳠(Mystusmacropterus)IL-1β的表达量先上升后降低[59].与之相似的是，在爱德华氏菌(E.ictaluri)刺激后，斑点叉尾鮰头肾中也出现了类似的趋势[54]，这表明IL-1β参与鱼体内的免疫反应，尤其是在抵抗病原体侵染的初期.

脂多糖(LPS)和聚肌胞苷酸(PolyI:C)可作为免疫系统的刺激物，被广泛用于模拟细菌和病毒感染的刺激，引起鱼类体内细胞因子的变化.LPS不仅可以刺激诱导软骨鱼IL-1β的表达[12]，也能增加硬骨鱼(如重唇鱼、黄鳍金枪鱼)脾脏、肾脏等组织中IL-1β的表达量[11,13,17-18,51,55].在LPS刺激后，鮸鱼各组织中IL-1β的转录水平均明显上调[13]；大口黑鲈(Micropterussalmoides)脾脏中IL-1β mRNA表达水平升高，而在头肾中无明显变化[58].不同鱼类物种应对LPS刺激产生了类似的应答反应，暗示着在这些鱼类中可能存在一种共同的IL-1β调节机制.研究表明，鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)能够上调金鲳鱼(Trachinotusovatus)肝脏、脾脏、肾脏等组织中IL-1β的表达[52].病毒模拟物PolyI:C促进了鮸鱼的多种组织中IL-1β表达量增加[13]，但仅略微提高黄鳝头肾白细胞mRNA表达水平[47].同样，黑鱼(Channaargus)头肾白细胞IL-1β也可被脂磷壁酸(LTA)、LPS和PolyI:C诱导表达[48].这些结果表明IL-1β在鱼类应对细菌和病毒感染过程中行使关键功能.

与哺乳动物的胸腺和骨髓构成的中枢免疫系统不同，鱼类的免疫相关组织为头肾、脾脏和血液.致病菌、病毒主要通过皮肤和鳃等途径感染鱼类，随后传播到其他内脏器官，其中，肝脏、脾脏和肾脏是感染后发生大量病原体侵入和增殖的主要器官.在多种鱼类中，IL-1β在鳃中的转录水平显著高于其他组织[11,20,48,51-52]，经病原体刺激后表达量显著增加，这可能暗示IL-1β在鳃中参与了这些鱼的急性炎症反应.

4 鱼类IL-1β的功能研究

IL-1β是一种具有多效性的细胞因子，参与宿主防御微生物入侵、炎症、免疫应答、代谢调节、造血过程和肿瘤转移等一系列反应[1,3-4].IL-1β主要由哺乳动物的单核细胞和巨噬细胞产生[6,61]，也由T细胞、NK细胞、内皮细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、肾上腺皮质细胞[62-63]和胰腺β细胞[64]等产生.IL-1β能够影响重要的细胞功能，例如:降低DNA含量、减少蛋白质合成和细胞内能量产生，诱导β细胞凋亡和坏死[3-4].

4.1 IL-1β相关信号通路研究

在哺乳动物中，IL-1β与Ⅰ型受体IL-1R1结合，在受体辅助蛋白IL-1RAP的帮助下募集含有TIR结构域的衔接蛋白MyD88[1-2,65].MyD88向下游传递信号激活白介素1受体相关激酶IRAKs和肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6.该信号促进与炎症和免疫反应相关的关键转录因子的激活，例如：NF-κB、AP-1、JNK、MAPK和ERK等[1-6,65].

对海参斑鱼的转录组数据分析显示，NF-κB和MAPK通路的大部分成员在海参斑鱼中均已存在[14]，这意味着在鱼类中可能存在类似于哺乳动物的信号通路.在细菌刺激后，除了促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α和COX-2)外，上调最高的2个分子分别是IκBa和IL-1R2，它们也参与了IL-1β的调节过程[14].在日本牙鲆中，通过微阵列分析发现，注射10 μgIL-1β基因的表达载体可诱导其头肾组织中93个基因的高表达，其中，包括TNF、TLR1、GCSF、MHCⅠ、β2-MG、IgM、CD3、CD20等[21]；在草鱼体内的研究发现，重组草鱼IL-1β可通过NF-κB和MAPK6信号通路同时上调草鱼头肾白细胞IL-1β和TGF-β1的表达.有研究指出，鲷鱼重组IL-1Fm2与PAMP联合使用时，能够激活金头鲷(Sparusaurata)吞噬细胞的呼吸爆发并协同诱导IL-1β的表达[23].此外，海参斑鱼nIL-1F能够抑制IL-1β1的表达，这一现象在草鱼中同样被证明[14,66]，这表明鱼类的nIL-1F是一种类似于哺乳动物的IL-1Ra的受体拮抗剂，通过与IL-1R1结合进而阻断下游信号.目前，鱼类IL-1β的功能尚不完全清楚，但它在先天免疫过程中激活吞噬细胞的活性，并且同Toll样受体(TLR)之间也存在关联作用.

4.2 鱼类IL-1β的抗菌、杀菌功能研究

到目前为止，大量的研究表明鱼类IL-1β参与了病原体感染后的炎症反应.为了进一步研究IL-1β在鱼类中的抗菌、杀菌作用，多种重组鱼类IL-1β(rIL-1β)蛋白及抗体被生产出来.

研究发现：注射IL-1β基因的鲤鱼对嗜水气单胞菌感染的抵抗力增加[67]；虹鳟重组IL-1β蛋白可以诱导体内巨噬细胞中COX-2和MHC Ⅱ的表达，腹腔注射仅1 μg rIL-1β即可增强腹腔白细胞的迁移和头肾巨噬细胞的吞噬功能，从而显著降低杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)感染导致的鱼类死亡率[68]；重组黑鱼IL-1β上调了头肾白细胞中内源性IL-1β的表达，同时在细胞内杀菌实验中显著降低了细菌的存活率，说明rIL-1β提高了黑鱼头肾白细胞的杀菌能力[48]；重组IL-1β可增强大黄鱼对溶藻弧菌的抵抗力，并在体外增加头肾巨噬细胞的迁移和吞噬活性[20]；在香鱼中，抗IL-1β抗体的中和作用降低了头肾单核/巨噬细胞的杀菌能力，但不改变它们的吞噬功能[49]；在草鱼中，抗IL-1β抗体可抑制嗜水气单胞菌诱导的草鱼肠道炎症[11].

研究证实，注射重组鱼类IL-1β可上调鱼类内源性IL-1β的表达，同时增强单核/巨噬细胞的迁移和吞噬细菌能力；而抗IL-1β抗体降低真核/巨噬细胞的杀菌能力.最近，在大菱鲆中研究显示，过表达IL-1β抑制了爱德华氏菌(E.ictaluri)在大菱鲆体内的定殖，而敲除IL-1β则在早期促进细菌在鳃中的定殖[42].这些研究表明，与哺乳动物IL-1β一样，鱼类IL-1β在抗菌防御中发挥重要功能，有助于机体抵御细菌感染.

4.3 鱼类IL-1β的佐剂效应研究

IL-1β具有广泛的生物学活性，主要参与调节炎症反应和诱导免疫应答.近年来，IL-1β被认为是哺乳动物[69-71]和鱼类[54, 72-74]疫苗的潜在免疫刺激剂.基于哺乳动物IL-1β进行序列比对，预测可能的成熟肽.结果显示，重组硬骨鱼IL-1β蛋白具有生物学活性，可引起一系列免疫反应[11,20,48,68].

在斑点叉尾鮰中，rIL-1β1和rIL-1β2蛋白通过提高抗体水平、血清杀菌活性、溶菌酶活性、替代补体溶血活性，增强了联合注射疫苗后的免疫应答[54].类似地，将重组IL-1β蛋白与灭活细菌同时注射鲤鱼体内，可产生更高的抗体凝集水平[73]；在牙鲆中使用重组IL-1β作为佐剂可以提高针对抗原、牛血清白蛋白或绿色荧光蛋白的抗体效价[72].此外，给鲤鱼喂食含皂苷(动物的免疫反应和抗体反应的良好佐剂)的豆粕后，IL-1β表达量的上调暗示其参与鲤鱼肠中豆粕诱导的肠炎的发病和恢复[75].

由此可知，鱼类IL-1β在免疫调节过程中发挥重要作用.重组鱼类IL-1β具有促炎性作用，与疫苗联合注射后，明显增加了抗体效价.这表明，鱼类IL-1β可作为细菌亚单位疫苗的潜在佐剂，应用于水产养殖中.

5 总结与展望

IL-1β作为一种促炎细胞因子，广泛参与鱼类体内的炎症和免疫调节活动.近年来，已经在越来越多的鱼类中克隆得到IL-1β基因.研究发现，鱼类IL-1β蛋白在结构上与哺乳动物有很多相似性.目前，对鱼类IL-1β功能的研究主要集中在病原体刺激后其在转录水平上的表达变化.大量的研究表明，鱼类IL-1β有助于机体抵御病原微生物的感染.此外，重组鱼类IL-1β蛋白可作为很好的佐剂，增强联合注射疫苗后的免疫应答.以上结果均表明，鱼类IL-1β在免疫调节过程中扮演着类似哺乳动物IL-1β的重要角色.然而，有关鱼类IL-1β功能的研究还不够深入和全面，仍有很多问题亟待更深入的研究：①IL-1β在鱼体中参与炎症反应的机制以及与哺乳动物信号通路之间的异同；②鱼类IL-1β是否参与了其他生命活动，如造血、代谢过程等；③可用于疫苗接种的更多鱼类物种的IL-1β.随着科技的进步和研究的深入，鱼类免疫调节机制等问题将逐渐被解决，这对鱼类疾病的防治具有重要意义，并为低等脊椎动物免疫系统的研究提供参考借鉴.