小分子肽LK-5对肝纤维化小鼠的防治效果初步研究

廖彭莹 杨玉蓉 韦引金 宋采鲜 黄艳莹 韦春凤 陈海平 李锦清 林燕媚

【摘 要】 目的：探讨小分子肽LK-5对CCl4致小鼠肝纤维化的防治效果。方法：将昆明小鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组和小分子肽低（15 mg/Kg）、高剂量组（60 mg/Kg）。采用皮下注射25%CCl4-橄榄油诱导建立小鼠肝纤维化模型。连续8周后，采用苏木精-伊红（HE）染色观察肝脏组织病理学变化，采用试剂盒法检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）的水平及肝组织中丙二醛（MDA）、过氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和羟脯氨酸（Hyp）的含量。结果：与模型组相比，小分子肽可改善小鼠肝组织病理学结构病变，显著降低CCl4致肝纤维化小鼠血清的AST、ALT水平和肝组织MDA、Hyp含量，肝组织GSH-Px和SOD含量均明显升高。结论：小分子肽对CCl4所致肝纤维化小鼠具有改善作用，其机制可能与抗脂质氧化和清除自由基有关，其是否通过肝内肾素-血管紧张素系统（RAS）发挥作用仍有待进一步研究。

【关键词】 小分子肽;肝纤维化;CCl4;防治

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）17-0038-04

Preliminary Studies on the Prevention and Treatment of the Peptide LK-5 on Carbon Tetrachloride Induced Hepatic Fibrosis in Mice

LIAO Pengying YANG Yurong WEI Yinjin SONG CaixianHUANG Yanying WEI Chunfeng CHEN Haiping LI Jinqing LIN Yanmei

Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China

Abstract：Objectives to investigate the protective effect of the peptide LK-5 on carbon tetrachloride induced hepatic fibrosis in mice. Methods The Kunming mice were randomly divided into normal group，model group，Colchicine group，low-and high-dose （15 and 60 mg/Kg） peptide groups. The mice were sc injected with 25%carbon tetrachloride （CCl4） to establish hepatic fibrosis model.Continuous 8w later，the liver histology of tissue pathology were determined by hematoxylin-eosin （HE） staining. The activities of the alaninetransarninase （ALT） and aspartate transferase （AST） of the serum and the activities of malondialdehyde （MDA），superoxide dismutase （SOD），glutathione peroxidase （GSH-Px） and hydroxyproline （Hyp） in liver tissue were investigated by related reagent kits. Results Compared with the model group，the pathological changes of liver histopathology wereimproved，the AST and ALT levels of the serum，the MDA and Hyp contents of the liver tissue were reduced，and the activities of GSH-Pxand SOD were increased significantly.Conclusions the peptide showed improvement effects on the hepatic fibrosis mice induced by CCl4，and the mechanism may be related with anti-lipoid peroxidation and clearing out free radicals. Whether the mechanism is related with the renin-angiotensin system （RAS） in liver remains to be further studied.

Keywords：Peptide; Hepatic Fibrosis; CCl4;Protective Effect

器官纖维化是是指由于炎症刺激导致器官实质细胞坏死，细胞外基质异常增多及过度沉积的一种病理过程，若不及时治疗会发展为器官硬化甚至器官衰竭[1]，肝纤维化是其中一种，是多种慢性肝病共同的病理变化，是肝硬化发展的必经阶段[2]。我国肝病发病率高、影响面广，约1.2亿人携带乙肝病毒，约1/4病人会发展成慢性肝病，包括肝纤维化[3]。

RAS系统是人体非常重要的内分泌系统[4]，其主要功能是维持血压稳定，同时局部组织RAS系统会通过自分泌、旁分泌和胞分泌等路径维持机体平衡，分泌过多会引起器官纤维化[5]。ACE（血管紧张素转化酶）为RAS系统的关键酶，主要功能是切除血管紧张素I（Ang I）的羧基端二肽生成血管紧张素II（Ang II），Ang II的主要功能是介导血管收缩，引起血压升高，同时Ang II可通过多种路径诱导或促进器官纤维化[6]。临床使用的ACE抑制剂卡托普利、赖诺普利、依那普利等除了具备降血压功能外，对局部组织RAS系统中ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang （l-7）-Mas轴的主要成分也能产生影响，从而抑制器官纤维化病变[7-9]。因此，以ACE为靶点筛选的活性物质可能具有控制血压、抑制器官纤维化病变等多重效应。

鳖甲为鳖科动物中华鳖（Pelodiscus sinensis Wiegmann）的背甲，有滋阴清热、退热除蒸、软坚散结的功效[10-11]。临床中医将单方炙鳖甲[12]及鳖甲复方[13-14]等用于治疗慢性肝纤维化。肽类成分是鳖甲的主要活性物质，已经从鳖甲中分离鉴定出多个具有抗肝纤维化的活性肽类[15-20]。在前期研究中，本课题组从鳖甲中分离鉴定了具有ACE抑制作用的小分子肽LK-5，IC50值为75.6 μmol/L[21]，其能否发挥抗肝纤维化作用值得探讨。本论文采用肝纤维化小鼠模型初步探讨了该小分子肽的防治效果。

1 材料与方法

1.1 动物 昆明种小鼠体质量（20±2）g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2016-0002，适应性饲养一周。

1.2 药物与主要试剂 小分子肽LK-5（>99.0%）由上海吉尔生化有限公司合成，秋水仙碱购自西双版纳版纳药业有限责任公司，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，CCl4为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限责任公司，橄榄油购自重庆江源油橄榄开发有限公司。

1.3 主要仪器 BSA224S 型电子天平（ 北京赛多利斯仪器系统有限公司），CP100NX型离心机（株式会社日立制作所），Infinite M200 PRO型全波长多功能酶标仪（瑞士TECAN），微板恒温震荡器（上海沪析实业有限公司），电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司），超纯水仪（南京易达科技发展有限公司）

1.4 分组、造模与给药 小鼠随机分为小分子肽低、高剂量组、空白对照组、模型组、秋水仙碱组，除模型组15只外，其余各组均为12只。采用皮下注射25%CCl4橄榄油溶液造模，1 次/3 d，每次2 mL/Kg。同时，小分子肽低、高剂量组按15、60 mg/Kg皮下注射给药，阳性对照组以秋水仙碱按0.4 mg/Kg灌胃给药，1次/d。正常组和模型组均灌胃等量生理盐水，1次/d，连续8周。

1.5 取材 末次给药后，小鼠断食不断水过夜，称定小鼠质量，摘取眼球取血。将血液于3000 rpm离心15 min后，收集上清液，-80 ℃保存待检。肝左叶用20%福尔马林固定，进行HE染色。取适量肝右叶低温制成10%肝匀浆，离心留上清液-80 ℃保存待檢。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠体质量及行为学变化 每3天称一次体重，记录小鼠体质量变化。记录小鼠每天进食量。观察小鼠的饮食量、毛发光泽程度和精神状态。

1.6.2 肝脏病理组织学检查 用10%甲醛溶液固定肝组织，常规石蜡包埋，4～6 μm 切片，HE染色后光镜下观察。

1.6.3 指标检测 按照试剂盒说明检测血清中ALT、AST、ALB水平及肝组织中总蛋白TP、MDA、SOD、GSH-Px和Hyp含量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行分析。所有数据均用（x±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，LSD检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义，P< 0.01，P<0.001 表示差异具有高度统计学意义。

2 结果与分析

2.1 一般状态 空白对照组小鼠体重增长，毛发光滑且致密，行动敏捷，二便正常。模型组小鼠食欲下降，体重增长较正常组缓慢，且精神萎靡不振，易怒易斗，毛发色泽暗淡紊乱，大便较稀，腹部胀气。秋水仙碱组体重增长较正常组缓慢。小分子肽低、高剂量组生长情况基本正常，体重增长介于正常组与模型组之间，毛发有光泽，行动如常。实验过程有动物死亡。

2.2 小鼠肝脏大体及病理学检测 空白对照组小鼠肝脏质地柔软，表面光滑且边缘锐利多呈红褐色，模型组小鼠肝脏质地较硬，表面油腻且外观有明显肿胀，颜色暗淡多呈土黄色，表面有颗粒结节状突起。小分子肽低、高剂量组肝脏外观接近正常组，表面鲜有颗粒结节状突起。

空白对照组肝细胞索排列整齐有序，中央静脉外肝细胞散发排列整齐，肝细胞无损伤，肝小叶结构无缺失，无炎症细胞浸润。模型组肝细胞索排列紊乱，肝细胞坏死且拥挤成团，肝小叶结构破坏，大量炎症细胞浸润，说明肝纤维化造模成功。秋水仙碱组肝细胞索排列整齐，肝细胞大多完整，肝小叶完整。小分子肽低剂量组偶尔可见肝小叶中央静脉缺失，肝索排列较清晰完整。小分子肽高剂量组肝小叶结构完整，肝细胞清晰完整。秋水仙碱与小分子肽低、高剂量均对小鼠肝纤维化症状有改善效果。各组小鼠肝组织切片HE染色情况见图1。

2.3 对血清指标的影响 与空白对照组相比，模型组的AST和ALT水平均显著升高，表明小鼠肝纤维化模型造模成功;与模型组相比，秋水仙碱和小分子肽低、高剂量组的AST和ALT水平均显著降低（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.001）。结果见表1。

2.4 对肝组织MDA、GSH-Px、SOD、Hyp的影响 与空白对照组相比，模型组的MDA与Hyp水平均不同程度升高，SOD与GSH-Px水平均显著降低（P<0.05，P<0.01）;与模型组相比，秋水仙碱和小分子肽低、高剂量组的MDA和Hyp水平均降低，SOD与GSH-Px含量均显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

3 讨论

肝纤维化的主要特征是细胞外基质沉积，CCl4是广泛使用的致小鼠肝纤维化的一种经典造模试剂[22]。肝纤维化水平常用指标以病理组织切片检查和反映胶原代谢的指标肝组织Hyp含量为主[23]。血清ALT、AST水平是反映肝功能的重要生化指标。CCl4刺激诱发氧化应激和脂质过氧化反应，MDA、SOD和GSH-Px水平从不同角度反映机体抗氧化能力，三者常共同检测[24]。

本实验以肝纤维化小鼠为模型，对小分子肽LK-5的抗肝纤维化作用进行了初步研究。模型组小鼠肝脏外观肿胀，血清ALT、AST水平及肝组织Hyp含量均显著上升，说明肝功能受损，提示造模成功。给予小分子肽LK-5，边造模边给药，结果表明小分子肽组小鼠的肝功能指标得到改善，ALT、AST、Hyp、MDA含量降低，SOD、GSH-Px的含量均显著上升，提示提高了机体的抗氧化水平，减轻肝细胞的氧化应激，改善了肝细胞所受破坏，对肝脏产生了一定的保护作用[25]。

近年来肝内RAS系统与肝纤维化疾病的相互关系愈来愈受到重视，鳖甲煎口服液被证实对肝纤维化大鼠的ACE-AngII-AT1R/ACE2-Ang（l-7）-Mas轴产生调节作用，从而抑制肝纤维化病变[26]。本实验表明具有ACE抑制活性的小分子肽LK-5对肝纤维小鼠具有一定的保护作用，可能与抑制脂质过氧化反应、增强肝脏抗氧化能力有关，其是否与肝内RAS系统相关有待进一步研究。

参考文献

[1]李才. 器官纤维化基础与临床[M]. 北京：人民卫生出版社，2003.

[2]GHOSH A K，QUAGGIN S E，VAUGHAN D E. Molecular basis of organ fibrosis： potential therapeutic approaches[J]. Experimental Biological Medicine 2013，238 （5）： 461-481.

[3]DING S，CHENN B. Pathogenesis of hepatic fibrosis analyzed at the proteome level[J]. Saudi Medical Journal2012; 33 （2）： 123-127.

[4]奚倩兰，刘凯，陈晓平. 《高血压合理用药指南》 解读之肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂治疗高血压并发症[J]. 中国循证医学杂志，2018，18 （1）： 2-7.

[5]MOREIRDE M S，GUIMARES T A.FEETENBERGER J D，et al. The role of renin-angiotensin system modulation on treatment and prevention of liver diseases[J]. Peptides，2014，62 （9）： 189-196.

[6]王金勝，曾庆富. 局部肾素血管紧张素系统与器官纤维化[J]. 国外医学·生理、病理科学与临床分册，2004，24 （1）： 367-369.

[7]TAZUKO O，HIDETSUGU S，KENSEI T，et al. Anti-fibrogenic effect of an angiotensin converting enzyme inhibitor on chronic carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosisin rats[J]. Hepatology Research，2001，21 （2）：147-158.

[8]HUANG M L，LI X，MENG Y，et al. Upregulation of angiotensin-converting enzyme （ACE） 2 in hepatic fibrosis by ACE inhibitors[J]. Clinical & Experimental Pharmacology Physiology，2010，37 （1）： e1-6.

[9]GOLNAR K，ALI M K，MASOUD S，et al. Attenuation of hepatic fibrosis through captopril and enalapril in the livers of bile duct ligated rats[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy，2008，62 （5）： 312-316.

[10]国家中医药管理局《中华本草》编委会，中华本草 [M]. 上海：上海科学技术出版社，1999（9）：389.

[11]国家药典委员会，中华人民共和国药典（一部）[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015：617.

[12]姜宏伟. 单味鳖甲治疗肝炎肝硬化30例 [J]. 临床医学，2007（6）：93-94.

[13]袁强，何岚，陈芝芸，等. 复方鳖甲软肝片对肝纤维化大鼠肝脏血管紧张素II及其受体mRNA表达的影响 [J]. 中华中医药杂志，2008，23（2）：158-161.

[14]王兵，侯炜. 《金匮要略》三丸方治疗肿瘤探讨 [J]. 中医学报，2013，28（10）：1451-1453.

[15]高建蓉，张赤志，邵志华，等. 鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究 [J].实用医学杂志，2007，23（11）：1618-1620.

[16]HU C L，PENG X Z，TANG Y P，et al. Synthesis of peptides of Carapax Trionycis and their inhibitory effects on TGF-β1-induced hepatic stellate cells[J]. Drug Discoveries &Therapeutics，2013，7 （6）： 248-253.

[17]SUN H T，CHEN G X，WEN B，et al. Oligo-peptide I-C-F-6 inhibits hepatic stellate cell activation and ameliorates CCl4-induced liver fibrosis by suppressing NF-kB signaling and Wnt/b-catenin signaling[J]. Journal of Pharmacological Sciences，2018（136）： 133-141.

[18]唐尹萍，鳖甲抗肝纤维化的药效物质及作用机理研究[D]. 武汉：湖北中医药大学博士学位论文，2011.

[19]HU C L，PENG X Z，TANG Y P，et al.Purification，characterization，in vitro anti-hepatic fibrosis activity of bioactive peptides derived from Carapax Trionycis hydrolysates[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2017，26 （8）： 605-610.

[20]WANG P，ZHANG Y，AN Y，et al. Protectionof anewheptapeptidefromCarapaxtrionycisagainstcarbontetrachloride-inducedacuteliverinjuryin mice [J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin 2013，61 （11）： 1130-1135.

[21]LIAO P Y，LAN X D，LIAO D K，et al. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme （ACE） inhibitory peptides from the enzymatic hydrolysate of Carapax Trionycis （the shell of the turtle Pelodiscus sinensis）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2018（66）：7015-7022.

[22]张巧红，徐艳玲，杨靖华. 丹参粉针剂对肝纤维化大鼠肝损伤的保护作用及对血管紧张素（ 1-7） 的影响[J]. 中华中医药学刊，2018（66）：7015-7022.

[23]闫冰，周晓辉，潘士勇，等. 软肝宁抗四氯化碳誘导的大鼠肝纤维化[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（14）：205-208.

[24]叶秋莹，张黎黎，黄自通，等. 溪黄草水提物对酒精性肝损伤的保护作用研究[J]. 中国民族民间医药，2020，29（21）：24-28.

[25]张宸豪，李瑶，李正祎. 姜黄素对四氯化碳诱导肝纤维化小鼠的保护作用研究[J]. 黑龙江畜牧兽医，2018（7）：167-169，252.

[26]LI X Y，PENG Y，BU X W，et al. Balancing effect of Biejiajian oral liquid onACE-Ang II-AT1R axis and ACE2-Ang-（1-7）-Mas axis inrats with CCl4-induced hepatic fibrosis[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2018，24 （11）： 853-859.

（收稿日期：2021-01-13 编辑：刘 斌）

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金（81960698）;2017 年广西中医药大学青年基金项目（2017QN011），中药学一流学科（桂教科研[2018]12号）;广西中医药大学药学院中药学学科青年教师提升计划（050170035）;广西中医药大学 2020 年自治区级大学生创新创业训练计划（202010600087）。

作者简介：廖彭莹（1984-），女，汉族，博士，副教授，研究方向为中药化学、天然药物化学。E-mail： gxlpy@163.com