基于化学成分差异的不同干燥方式熊胆粉镇痛作用研究

杨俊莉，钟林江，雷 阳，邓 妍，高天赐，徐玉玲*，刘 涛,4，张 坤

1.成都大学药学院，四川 成都 610106

2.成都大学食品与生物工程学院，四川 成都 610106

3.成都柏瑞泰生物科技有限公司，四川 成都 610106

4.四川省抗病毒中药产业化工程技术研究中心，四川 成都 610106

熊胆为我国名贵中药材，药用为脊索动物门哺乳纲熊科熊属黑熊Selenaretos thibetanusCuvier及棕熊UrsusarctosLinnaeus的胆囊，被誉为“药中黄金”[1]。目前，广泛应用于临床的熊胆粉，为黑熊经胆囊手术引流胆汁干燥而得，具有清热解毒、平肝明目、杀虫止血等功效[2]，属于原国家卫生部批准的一类新药。据《中国熊胆粉市场供需情况与发展趋势研究报告（2015—2020）》统计，由国家药品监督管理局正式批准的合法药品中，含熊胆粉的中药制剂有243种[3]。据调查，熊胆粉现行大生产干燥方式多采用常压干燥，其干燥温度高、时间长，经济效益低，造成资源浪费。不同的干燥方式的加热方式及原理存在差异，必然会导致干燥产物的物理性质及成分含量的不同[4-5]。目前未见熊胆粉的生产工艺对其化学成分及药理作用影响研究相关报道。

动物类中药是中药中极具特色的一部分，其药性峻猛，药效成分不明确。但多数动物类中药的质量标准可控性差，无法准确评价药材质量，在一定程度上制约了动物类中药的发展。熊胆粉的化学成分主要包括胆酸类、胆固醇、色素类、磷脂、氨基酸、无机盐以及微量元素等[6]。目前熊胆粉的研究热点主要集中在其含量较高的胆汁酸类成分，忽略了非胆汁酸类成分与其协同发挥药效的作用。文献研究发现，熊胆粉在肝胆系统、心脑血管系统及抗肿瘤等方面展示出良好的药效活性[7]。林国华等[8]发现熊胆粉能有效抑制肝胆疾病引起的腹痛；韩莹等[9]、周超凡等[10]报道熊胆粉能有效减轻冠心病等引起的胸痛。

超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）已被广泛应用于中药化学成分的快速鉴定、药物质量控制等多个研究领域[11-12]，可通过将LC-MS扫描的碎片离子信息和化合物裂解规律与对照品或文献比对来快速、准确地分析中药中所含化学成分[13-14]。

本研究遵循熊胆粉历史药用方法，结合现代制剂技术的发展，采用常压及减压干燥制备熊胆粉，采用UPLC-QTRAP-MS技术对常压、减压干燥熊胆粉进行检测，比较其差异成分，并以网络药理学为指导，利用计算机模拟和各种数据库筛选药物分子作用靶点，预测其信号通路和作用机制，采用相关软件进行化合物-靶标-通路网络可视化[15-16]，探究常压、减压干燥熊胆粉对病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的潜在作用靶点及作用机制，并进行镇痛药效学验证，从整体上探索药物与疾病的相关性，为阐明熊胆粉药效物质基础、提高其质量控制水平奠定了基础。

1 仪器与材料

Shimadzu Nexera X2 CBM30A超高效液相色谱，日本岛津有限公司；4500 QTRAP串联质谱，Applied Biosystems公司；100 μL移液枪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；1 mL注射器、5 mL注射器，湖南省绿洲惠康发展有限公司；800Y高速多功能粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司；SHZ-C型循环水式真空泵，巩义式予华仪器有限责任公司；FA2004电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；DZF-6050A真空恒温干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；YLS-6B智能热板仪，山东省医学科学院设备站。熊胆汁，采自四川养麝研究所，批号为201905028，经成都大学刘涛研究员鉴定为熊科熊属黑熊S.thibetanusCuvier胆汁；变色硅胶，成都市科隆化学药品有限公司，批号2017050102；甲醇、乙腈，色谱纯，Merck公司；水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯，均购自成都市科隆化学品有限公司。

SPF级小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，成都达硕实验动物有限公司，批号为190729，许可证号：SCXK（川）2015-030。所有动物实验遵循《四川省实验动物管理条例》有关实验动物管理和使用的规定，均符合3R原则。

2 方法与结果

2.1 UPLC-QTRAP-MS检测

2.1.1 色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱：0～10.0 min，95%～10% A；10.0～11.0 min，10% A；11.0～11.1 min，10%～95% A；11.1～14.0 min，95% A；体积流量0.35 mL/min；柱温40 ℃；检测波长245 nm；进样量5 μL。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）操作参数如下：离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子喷雾电压（IS）+5500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源气体I（GSI），气体II（GSII）和帘气（CUR）分别设置为344.738、413.685、172.369 kPa（50、60、25.0 psi），碰撞诱导电离参数设置为高。在QQQ和LIT模式下分别用10、100 μmol/L聚丙二醇溶液进行仪器调谐和质量校准。QQQ扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。各离子对根据优化的去簇电压（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）进行扫描检测。

2.1.3 供试品溶液制备及分析 取洁净的熊胆汁供试样品，分别进行常压干燥（热风循环温度105 ℃；时间36 h 18 min）和减压干燥（温度65 ℃；压力-0.08 MPa；时间25 h 53 min），研磨（30 Hz、1.5 min）至粉末状，即得熊胆粉；称量熊胆粉50 mg，溶解于1 mL 70%甲醇中，振荡5 min，冰上静置15 min；在4 ℃条件下，12 000 r/min离心10 min，离心后吸取上清液400 μL到对应的EP管中；静置于-20 ℃冰箱，过夜；在4 ℃条件下，12 000 r/min再离心3 min；离心后取上清200 μL用微孔滤膜（0.22 μm）滤过样品，于对应进样瓶内衬管中，用于UPLC-MS/MS分析。

2.2 网络药理学预测

2.2.1 数据库与软件 数据库：PharmMapper（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html；PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Uniprot（https://www.uniprot.org/）；GeneCards（https://www.Gene cards.org/）；STRING（https://string-db.org/cgi/ input.pl）；DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；VENNY（https://bioinfogp.cnb.csic.es）；软件：Cytoscape 3.6.0；Prism 6。

2.2.2 核心靶标获取 通过PubChem数据库[17]，检索UPLC-QTRAP-MS检测出的常压、减压熊胆粉的8种差异成分的3D结构，在PharmMapper数据库中检索得到化学成分对应靶点的Uniprot ID，运用Uniprot数据库，检索靶标名称，得到相应基因。根据腹痛、胸痛相关的临床表型合集，通过GeneCards数据库检索virus hepatitis（病毒性肝炎）、cholecystitis（胆囊炎）、coronary disease（冠心病）疾病靶点，建立疾病的相关基因集。运用Venny2.0网站得到成分与疾病的交集基因。

2.2.3 靶点通路分析 运用DAVID数据库中进行基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析，观察潜在作用靶标的生物学功能。依据通路富集结果，选择前20个条目使用GraphPad Prism 6.0软件绘制柱状图。选择KEGG分析结果前20条信号通路使用Omicshare 数据库（http://www.omicshare.com）绘制高级气泡图。

2.2.4 PPI网络构建 根据药物靶点与疾病靶点的交集基因，通过STRING数据库构建PPI网络。

2.2.5 成分-靶标-通路网络构建及分析 根据KEGG信号通路富集分析结果前20个通路对应基因，以及基因对应化合物，构建成分、核心靶标和关键通路之间相互作用关系表，运用Cytoscape 3.8.0软件构建成分-靶标-通路网络图，进行可视化分析，进一步探讨熊胆粉镇痛的分子机制。

2.3 镇痛药效实验

2.3.1 供试品溶液制备 分别取“2.1.3”项下所制备的常压、减压熊胆粉适量，精密称定，加入纯化水配制成适宜质量浓度的溶液，超声溶解（功率240 W，频率40 kHz），即得。

2.3.2 热板法 取体质量18～22 g经痛阈筛选合格（痛阈在5～30 s）的SPF级小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组：生理盐水组（5 mL/kg）、阿司匹林组（0.08 g/kg）、常压干燥及减压干燥熊胆粉组（0.208 g/kg）。给药前测定其自放在热板上至出现舔后足所需时间作为该鼠正常痛阈值，连续ig给药7 d，于第7天测定给药后30、60、90、120 min时的痛阈值。

2.3.3 醋酸扭体法 取体质量18～22 g小鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，雌雄各5只。分组及给药剂量同热板法，ig给药连续7 d。末次给药0.5 h后ip 0.6%醋酸0.2 mL/只，观察15 min内各鼠扭体潜伏期及其出现扭体反应次数。

3 结果

3.1 熊胆粉成分鉴定

图1 常压、减压熊胆粉混合质谱分析总离子流图Fig.1 Mass spectrometry total ion chromatogram of mixture of atmospheric and vacuum bear bile powder

图2 MRM代谢物检测多峰图Fig.2 Multimodal graph of MRM metabolite detection

利用软件Analyst 1.6.1处理质谱数据。图1、2 所示为混样质控QC样本的总离子流图（total ions current，TIC）及MRM代谢物检测多峰图（多物质提取的离子流谱图，XIC）。

为了比较所有检测到的代谢物中每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰形的信息，对每个代谢物在常压、减压熊胆粉以及混合样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。图3展示了随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果。

采用UPLC-MS/MS法对常压干燥、减压干燥熊胆粉进行成分定性及定量鉴定，从常压干燥熊胆粉中发现了724个化学成分，从减压干燥熊胆粉中发现了个726化学成分，交集成分721个，差异成分8个，结果见表1和图4，其中差异成分为定性结果。根据峰面积显示，交集成分主要有胆汁酸、甘油磷脂类、有机酸类、脂肪酰类、氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，包括甘氨熊脱氧胆酸、甘氨猪去氧胆酸、猪去氧胆酸、溶血磷脂酰胆碱、棕榈油酸、马尿酸、犬尿酸等。

3.2 网络药理学结果

3.2.1 核心靶标获取 将筛选出的8种差异化学成分，通过PharmMapper数据库搜索得到药物潜在靶点共1605个，主要包括木葡聚糖内转糖基化酶、磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶、谷氨酰-tRNA还原酶、同质儿茶酸分解代谢双功能异构酶/脱羧酶、基因组多蛋白、核糖核酸酶HII、蛋白recA等；通过GeneCards数据库检索得到病毒性肝炎靶点7444个、胆囊炎靶点636个、冠心病靶点7563个，通过Venny2.0得出差异成分对病毒性肝炎、胆囊炎、冠心病的交集基因有282个，见图5，包括Friend白血病整合1转录因子（friend leukemia integration 1，FLI1）、cGMP抑制3,5-环磷酸二酯酶B（cGMP-inhibited 3,5cyclic phosphodiesterase B，PDE3B）、蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶2（protein-glutamine γ- glutamyltransferase 2，TGM2）、胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、果糖醛缩酶B（fructose-bisphosphate aldolase B，ALDOB）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Toll样受体1（Toll-like receptor 1， TLR1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Fes/Fps（tyrosine- protein kinase Fes/Fps，FES）、半乳糖激酶（galactokinase，GALK1）、Ras相关蛋白Rab-31（Ras-related protein Rab-31，RAB31）等。

图3 代谢物定量分析积分校正Fig.3 Quantitative analysis integration correction of metabolites

表1 常压干燥、减压干燥熊胆粉差异成分Table 1 Differential components of normal pressure drying and vacuum drying bear bile powder

图4 常压、减压熊胆粉成分交集图Fig.4 Composition diagram of normal pressure and reduced pressure bear bile powder

图5 成分与疾病交集基因图Fig.5 Intersection gene map of components and diseases

3.2.2 靶点通路分析 DAVID中GO功能富集分析得到GO条目759个（P＜0.05），其中包括小分子代谢过程、有机物代谢过程、有机氮化合物代谢过程、细胞代谢过程、初级代谢过程、生物调节、多细胞生物过程的调控、对有机物质的反应、发展过程等生物过程（biological processes，BP）条目717个，包括细胞质、细胞内受体、胞质溶胶、细胞器腔、细胞器、膜结合细胞器等细胞组成（cellular component，CC）条目21个，包括结合、催化活性、蛋白质结合、有机环状化合物结合、离子结合、杂环化合物结合、小分子结合等分子功能（molecular function，MF）条目21个。

分别选择前20个用GraphPad Prism 6.0软件绘制柱状图，结果见图6～8。KEGG通路富集筛选得到28条信号通路（P＜0.05）见表2，涉及癌症通路、前列腺癌通路、原发性免疫缺陷通路、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢、谷胱甘肽代谢等。选择前20条信号通路，使用Omicshare数据库绘制气泡图，见图9，PPI网络图如图10所示。

图6 GO富集分析 (生物过程)Fig.6 GO enrichment analysis (biological processes)

图7 GO富集分析 (细胞组成)Fig.7 GO enrichment analysis (cellular component)

图8 GO富集分析 (分子功能)Fig.8 GO enrichment analysis (molecular function)

表2 常压、减压干燥熊胆粉成分与疾病交集基因KEGG通路Table 2 Intersection gene KEGG pathway between components and disease of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

3.2.3 网络构建及分析 成分-靶点网络由Cytoscape 3.7.0构建得到129个节点，如图11所示，其中菱形为对应化学成分、椭圆形为对应基因、飞镖形为对应通路。结果采用度（degree）、平均最短路径（ASPL）、中介中心度（BC）和接近中心性（CC）排序确定关键节点，网络中度值≥中位数（成分度值中位数＝12.5，靶标度值中位数＝5）的成分分别是鸟苷5′-单磷酸水合物、甲基间酪氨酸、左旋甲状腺素及大黄素8-葡萄糖苷。靶标有二氢硫辛酸脱氢酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD）、过氧化氢酶-2（cationic amino acid transporter，CAT）、一氧 化氮合酶（nitric oxide synthase 2，NOS2）、囊泡蛋白（golgi transport 1，GOT1）、过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶（peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase，ACOX）、甾醇o-酰基转移酶1（acetyl-CoA acetyltransferase 1，ACAT1）、羟酸氧化酶 1（hydroxyacid oxidase 1，HAO1）、Creb结合蛋白（CREB-binding protein，CREBBP）、腺苷酸琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）、前蛋白转化酶枯草杆菌素（proprotein carrier protein，PC）、精氨基琥珀酸合酶（argininosuccinate synthase，ASS）。通路主要有代谢通路和癌症通路。

3.3 药效实验结果

3.3.1 热板法 对小鼠热板致痛抑制作用如表3所示，结果表明，与生理盐水组比较，常压、减压干燥熊胆粉均能在60 min显著提高小鼠痛阈值（P＜0.05、0.01），其中常压与减压干燥组比较，具有显著性差异（P＜0.01）。

3.3.2 醋酸扭体法 对小鼠醋酸扭体致痛抑制作用如表4所示，结果表明，常压、减压干燥熊胆粉对小鼠醋酸所致疼痛均有一定的抑制作用，并能延长小鼠发生扭体反应的潜伏期，与生理盐水组比较，具有显著性差异（P＜0.01）。

图9 KEGG富集分析前20个通路气泡图Fig.9 Bubble chart of top 20 channels of KEGG enrichment analysis

图10 KEGG前20条通路基因PPI网络图Fig.10 PPI network diagram of top 20 pathway genes of KEGG

图11 常压、减压熊胆粉差异成分-靶标-通路网络图Fig.11 Differential composition-target-pathway network diagram of normal pressure and reduced pressure dried bear bile powder

表3 小鼠给药前后平均痛阈值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

表3 小鼠给药前后平均痛阈值 ( ±s,n = 12)Table 3 Average pain threshold of mice before and after administration ( ±s,n = 12)

与生理盐水组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与减压干燥组比较：▲▲P＜0.01，表4同*P < 0.05 **P < 0.01 vs normal saline group; ▲▲P < 0.01 vs vacuum drying group,same as table 4

组别 给药前平均痛阈值/s 给药后不同时间平均痛阈值/s 30 min 60 min 90 min 120 min 生理盐水 19.69±4.47 20.36±13.66 16.29±4.44 17.17±10.78 15.72±6.13 常压干燥 19.88±6.28 20.44±10.34 22.30±15.09*▲▲ 26.55±18.94▲▲ 18.38±6.59 减压干燥 19.83±5.39 23.60±14.87 28.68±18.71** 21.67±14.65 20.16±8.19 阿司匹林 18.79±6.60 28.87±19.22 26.04±17.34 22.65±13.90 19.64±5.85

表4 小鼠扭体潜伏期及15 min内平均扭体次数 ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

表4 小鼠扭体潜伏期及15 min内平均扭体次数 ( ±s,n = 10)Table 4 Latency period of mouse torsion and average times of torsion in 15 min ( ±s,n = 10)

组别 小鼠扭体潜伏期/min 15 min内扭体次数 生理盐水 4.42±2.51 36.10±21.59 常压干燥 6.46±2.80 15.80±16.14**▲▲ 减压干燥 5.93±2.80 22.50±9.81** 阿司匹林 8.80±3.83 8.20±5.65

4 讨论

熊胆粉的文献报道主要活性成分熊去氧胆酸（ursodesoxycholic acid，UCDA）可通过人工合成途径获得，一定程度上为其替代品提供了可能性，但有专家表明熊胆粉的功效在于其UCDA与其他多种成分的协同作用，人工合成UCDA难以完全替代其疗效。本研究采用UPLC-MS/MS及高通量筛选的方法代替数据库筛选，分析测定了常压及减压干燥熊胆粉上千种化学成分，明确其差异性，高效研究其中活性成分，排除与主治无关或毒性成分。解决了目前仅基于一种或几种代表性化合物相似性对药物的药效进行预测的问题。同时，在网络药理学指导下研究各组分对多靶点的活性，预测常压干燥及减压干燥差异成分镇痛作用机制，通过拓扑参数分析得到常压干燥及减压干燥熊胆粉差异成分治疗病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病3种疾病的关键成分有鸟苷5′-单磷酸水合物、甲基间酪氨酸、左旋甲状腺素及大黄素8-葡萄糖苷，关键基因有FLI1、PDE3B、TGM2、IGF1R、ALDOB、PCNA、TLR1、FES、GALK1、RAB31，涉及的关键通路有癌症通路及代谢通路。

文献研究表明熊胆粉可以显著调节丙型肝炎模型树鼩体内的牛磺酸及亚牛磺酸代谢、甘油磷脂代谢、色氨酸代谢及初级胆汁酸代谢途径的扰动，从而治疗病毒性肝炎[19]。常压、减压熊胆粉8种差异成分中大黄素和益母草碱为质谱实验中通过数据库检定出的成分，而目前文献报道熊胆粉成分大多为胆汁酸类、氨基酸类及微量元素等，未见报道大黄素、益母草碱，有待进一步进行分离鉴定，但文献研究表明，大黄素[20]具有保护心血管、保肝护肺等生物活性，益母草碱[21]也在文献报道中体现出有直接的保护心肌细胞损伤作用，这可能为熊胆粉治疗病毒性肝炎、胆囊炎及冠心病的药效物质基础提供依据。本实验结果表明，熊胆的主要药效物质基础除以往认识的熊去氧胆酸及牛磺熊去氧胆酸等胆汁酸成分外，还有氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物等，解决了动物药成分复杂，药效物质基础研究不明确，且功效与成分难以关联的问题。

在此基础上，对网络药理学的研究结果进行了进一步的验证，结果表明常压干燥及减压干燥熊胆粉均具有镇痛作用，且2种干燥方式镇痛作用具有显著性差异，因而得出干燥方式使得熊胆粉的化学组成存在一定差异，导致其镇痛作用差异，且网络药理学得出结果中关键药效成分均来源于减压干燥，而常压干燥温度高，时间长，故本实验建议大生产中采用减压干燥制备熊胆粉，研究成果为后续制剂工艺的选择以及药效物质基础研究提供了参考。在分析成分的同时，发现其个别成分含量也存在差异，这也可能是造成其镇痛作用差异的原因，后续有待进一步研究。

研究基于UPLC-QTRAP-MS和网络药理学，揭示了熊胆粉镇痛的多成分、多靶点的协同抗菌作用特点，较合理地解释了熊胆粉在镇痛方面临床应用的科学性。但本研究仅采用了小鼠热板法和醋酸扭体模型对熊胆粉镇痛药效进行了验证，热板法为热刺激小鼠足部产生痛反应，即舔足反应，以小鼠出现舔足的时间作为痛反应指标；醋酸扭体模型为腹腔注射损伤物质引起受试动物腹痛，表现为“扭体反应”，即腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起。而不同动物模型其表现的镇痛作用机制有一定差异，因而导致实验结果差异，后续将进一步研究其作用机制。

志谢：嘉兴迈维代谢生物科技有限公司对熊胆粉UPLC-MS/MS检测及分析数据的贡献。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突