贵州芸豆虫害菜豆象的调查与鉴定

赵 阳，王 艳，林雪丹，罗阿东，陈 霄，李 洁，焦彦朝2，*

(1.六盘水市口岸服务中心，贵州 六盘水 553000；2.国家果蔬检测重点实验室(六盘水)，贵州 六盘水 553000；3.贵阳海关综合技术中心，贵州 贵阳 550081)

菜豆象[Acanthoscelidesobtectus(Say)]属鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchidae)三齿豆象属(Acanthoscelide)，原产于南美和中美，目前已分布于亚洲、欧洲、非洲、美洲及大洋洲等5大洲。随着国际经济贸易的频繁往来，我国部分豆类产地有菜豆象分布，与我国相邻的日本、缅甸等国家亦有分布[1-2]。菜豆象主要危害菜豆属的植物，同时也危害蚕豆、绿豆及豌豆等其他多种豆类。其以幼虫在豆粒内隐蔽蛀食，造成豆粒的品质和重量下降，尤其对豆类储藏期间构成较大威胁。研究表明，菜豆象危害不仅影响豆类发芽率，降低产量，而且在豆类储藏期间的危害可造成重量损失达60%以上[3]，危害较大，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》[4]，在国际上被列为豆类植物的重要检疫对象之一[5-6]。由于菜豆象传播范围广、适应性强、危害严重、防治困难，因此该虫被农业部列入《全国农业植物检疫性有害生物名单》，菜豆、芸豆和豌豆等豆类植物籽粒列入应施检疫的植物及植物产品名单[7]。根据《全国农业植物检疫性有害生物分布行政区名录》，其中菜豆象在我国吉林、贵州及云南等3省44个县(区、市)均已有疫情发生，且在贵州省内37个县(区、市)已有菜豆象危害[8]。

芸豆也称菜豆，是菜豆象的高危寄主。芸豆具有较高的食用营养价值和药用价值，是贵州传统的出口土特产，也是出口创汇的农副产品，芸豆出口排贵州农产品出口的第4位[9-10]。贵州省是我国芸豆主产区之一，是全国第3大芸豆出口省[11]，芸豆对当地农民增收具有重要意义。有研究显示，贵州省菜豆象疫情较为严重[12]，毕节市所辖8个县(区)均有菜豆象疫情分布，有25万kg豆类受害[13]，严重影响贵州省芸豆的产量及品质。

由于昆虫早期虫态(卵、幼虫及蛹)的形态学鉴定一直都是鉴定工作中的难点，往往需要培养至成虫才能准确鉴定到种，通过种间细微的形态差异在口岸进行检疫检验需要至少10 d的检测周期，不适于口岸快速检疫的要求[6]。PCR法特异性强、灵敏度高且便捷快速[14]，不受样本发育阶段的影响，适用于我国进出境植物有害生物检疫。鉴于此，针对贵州豆类产品的特点，对贵州芸豆样品进行随机抽样，采用形态学和分子生物学相结合的方法对菜豆象的发生进行调查和鉴定，掌握贵州芸豆中菜豆象疫情情况，以期为有效控制贵州芸豆菜豆象的发生，提高有害生物检疫技术，保障芸豆产品出口安全提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品及来源

1.1.1 芸豆样品 114份芸豆样品采集于贵州芸豆主产地六盘水、毕节及主要集散地贵阳等地市场，每份样品约500 g。其中，贵阳29份，编号GY1～GY29；六盘水26份，编号LPS1～LPS26；毕节59份，编号BJ1～BJ59；企业送样223份，编号为QY1～QY223。

1.1.2 试剂 DNA提取试剂盒MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit，PCR反应预混液Premix Taq(2×)，引物C1、C2，购自Takara公司。

1.1.3 仪器 LXZ-260B270L人工气候箱，宁波江南仪器厂；SZX16体视显微镜，日本OLYMPUS；5345梯度PCR仪，德国Eppendorf；Universal高压电泳系统，美国BIO-RAD；DOCXRS化学发光凝胶成像系统，美国BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 昆虫饲养方法 检查豆粒上是否有幼虫注入孔，是否有“小窗”或羽化孔，每份样品抽取一部分(尽量选取有虫眼的芸豆，100 g)放入人工气候箱。根据菜豆象的生物学特性，将人工气候箱温湿度调至菜豆象卵期、幼虫期最适的发育温度30℃及相对湿度70%～80%，进行人工饲养，以获取昆虫成虫样本[5，15]。

1.2.2 形态学鉴定 对饲养出的昆虫成虫，在体视显微镜下根据菜豆象的形态学特征进行种类鉴定。

1.2.3 分子生物学鉴定 PCR扩增体系：按照DNA提取试剂盒说明书提取菜豆象成虫的DNA，利用菜豆象特异性引物(C1：GCCACCTTTCATGGAACTCAA，C2：TGCAAATACAGCTCCTATAGAAAGAACA)[16]进行PCR扩增，其预期扩增产物大小为192 bp。反应总体系为50 μL，其中PCR反应预混液Premix Taq(2×)25 μL、引物的终浓度均为0.2 μmol/L，模板DNA为200 ng，用无菌ddH2O补足50 μL。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，40个循环；72℃延伸10 min；反应结束后4℃保存。PCR产物的检测方法：取10 μL PCR产物，在1%琼脂糖凝胶和1×TBE缓冲液中电泳50 min(80 V)，GoldView溶液染色20 min后经凝胶成像系统拍照记录结果。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

通过体视显微镜观察，成虫体长2～4.5 mm，头、前胸背板及鞘翅表皮黑色，鞘翅端部边缘橘红色。腹部橘红色，仅腹板基部有时呈黑色；臀板橘红色。触角11节，其中第1～4节呈橘红色丝状，有时包括第5节基半部；第5～10节呈黑色锯齿状；末节端部尖细，呈橘红色。鞘翅密被黄色毛，在近鞘翅基部、中部及端部有裸色毛斑。后足腿节腹面近端有1长而尖的大齿，后跟2～3个小齿，大齿的长度约为前2个小齿的2倍，符合菜豆象的形态学特征，初步判定为菜豆象[5，15]。

2.2 分子生物学鉴定

从图1看出，以可疑菜豆象的成虫基因组DNA为模板，使用菜豆象、绿豆象和四纹豆象的特异性引物进行扩增，仅菜豆象能够扩增得到1个分子量为192 bp的特异性条带，与目标基因分子量大小一致，而绿豆象、四纹豆象及空白对照均无特异性条带产生，进一步表明在芸豆样品中检出了菜豆象。

注：M为D2000 DNA Marker，1～2为菜豆象，3～4为绿豆象，5～6为四纹豆象，7为空白对照。

2.3 芸豆中菜豆象的发生与分布

2.3.1 芸豆中菜豆象的发生 在114份产地样品中菜豆象检出数为9份，检出率为7.9%；企业送样的223份芸豆样品中菜豆象检出数为0份，检出率为0%；与企业送样芸豆样品相比，市场来源样品中存在菜豆象危害的风险较大。同时，形态学与PCR法菜豆象检出结果一致，表明，PCR法可应用于检疫有害生物菜豆象。

2.3.2 菜豆象检出芸豆的种类及来源 由表1可见，毕节市59份芸豆样品中检出菜豆象2份，均来源于毕节市农贸批发市场；贵阳市29份芸豆样品中检出菜豆象7份，其中，6份来源于贵阳市粮油批发市场，1份来源于超市。菜豆象检出芸豆种类覆盖大芸豆、红芸豆、大白芸豆和紫花芸豆等，涉及芸豆种类较广；市场销售的芸豆仍需进一步追溯其来源地。

表1 菜豆象检出芸豆种类及来源

3 结论与讨论

调查发现，在市场销售的芸豆中检出菜豆象，114份样品检出9份，检出率为7.9%；企业送样的芸豆中未检出菜豆象。究其原因：一是企业因为从事多年的农产品贸易，具有较强的检疫意识；二是芸豆在企业销售前都经过人工挑选和熏蒸除害处理，提高了芸豆品质，降低有害生物的携带率和感染率。而市场销售的芸豆大多数从种植农户或经销农户手上收购，未经过任何加工和除害处理，携带有害生物的机率大幅增加。

形态学鉴定在昆虫成虫种类鉴定中具有简单、直观、快捷的优势，但需具有丰富的经验，否则在遇到近缘种或区别近似种上有可能出现鉴定错误。同时，由于昆虫早期虫态的形态学鉴定往往准确性不高，因而不适于口岸快速检疫的要求[6]；而分子生物学鉴定周期短，且不受昆虫早期虫态的限制[16]，DNA是遗传信息的载体，从其上获得的信息既准确又可靠，不会随昆虫发育阶段变化而不同，可以弥补形态学上难以鉴别区分种类的缺陷[17-18]。因此，该研究采用形态学和分子生物学方法相结合进行鉴定，结果表明，2种方法互相验证，可同时鉴定贵州省芸豆菜豆象疫情情况；同时也证实，为满足今后检疫工作发展的需要，可使用分子生物学鉴定方法鉴定处于不同发育阶段菜豆象的虫害情况，缩短检疫时间。

市场销售的检出菜豆象的芸豆种类覆盖大芸豆、红芸豆、大白芸豆和紫花芸豆等，涉及芸豆种类较广，仍需进一步追溯其来源地，有效控制芸豆产地菜豆象危害继续发生。

使用快速检疫菜豆象的方法，可为企业豆类产品出口提供技术支撑，促进贵州芸豆产业的健康发展。同时应加强与相关部门交流合作，实现资源信息共享，共同做好菜豆象的防控，扩大贵州芸豆出口。