橙皮素通过激活内质网应激C/EBP同源蛋白诱导人神经胶质瘤细胞凋亡实验研究

韩福新，马善波，张 蕊

(1.西安市人民医院·西安市第四医院，陕西 西安 710004；2.空军军医大学西京医院，陕西 西安 710032)

胶质瘤是成人常见的中枢神经系统恶性肿瘤之一，其临床特点是侵袭性生长，恶性程度高，预后差[1]。临床常规手术治疗无法彻底切除胶质瘤组织，而残存的肿瘤对放化疗敏感性低，故胶质瘤复发率高，严重影响患者预后[2-3]。因此，寻找高效、低毒的新型抗胶质瘤药物极为必要。研究发现，中医辨证论治在改善癌症患者症状、延长患者生存期方面效果较好[4]。橙皮素(Hesperetin，HES)是来自于芸香科柑橘类植物果实的二氢黄酮类化合物，是多种中药如枳实、枳壳、陈皮、佛手等的活性成分，具有降血压、降血脂、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物学活性，其中抗肿瘤作用最为突出，是当前抗肿瘤药物研究热点之一[5]。已有研究证实，HES在肺癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌和结肠癌等多种肿瘤细胞中均具有抗癌活性，其通过抗氧化、抗炎和诱导肿瘤细胞凋亡等途径发挥抗癌作用[6-7]。但HES对胶质瘤的作用效果及作用机制尚未见报道。本研究旨在探讨HES在体外对人神经胶质瘤细胞的抗癌活性及相关信号转导机制，以期为胶质瘤的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞株：人神经胶质瘤细胞株U251购自上海奥陆生物科技有限公司。

1.1.2 实验试剂：HES(成都德斯特生物技术有限公司)；胎牛血清(Fetal bovine serium，FBS)、青霉素、链霉素均购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司)；脂质体Lipofectamine TM2000转染试剂(上海生工生物工程股份有限公司)；siRNA-CHOP及其阴性对照siRNA-NC购自上海吉凯基因科技有限公司；4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，4-PBA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；CCK-8试剂盒(美国GlpBio公司)；细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司；Hoechst 33258染色试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均购自南京凯基公司；反转录及扩增试剂盒(日本Ta Ka Ra公司)；ECL发光试剂(美国Bio-Rad公司)；分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(Glucose-regulated protein 78，GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)、X盒结合蛋白1(X-box blinding protein 1，XBP-1)、激活转录因子6(Activating transcription factor 6，ATF6)、真核起始因子2α(Eukaryotic initiationfactor 2α，eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、Caspase-3、剪切Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、多聚ADP核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP)、剪切PARP(Cleaved-PARP)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、兔抗人单克隆抗体、辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 实验仪器：Varioskan LUX 多功能酶标仪(美国Thermo公司)；LH-AA9626紫外分光光度计(北京连华永兴科技发展有限公司)；恒温CO2培养箱(美国Thermo公司)；Lter Epics XL流式细胞仪(美国Beckman-Coulter公司)；台式离心机、高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；天能化学发光凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；DYY-8C电泳仪、CFX96实时荧光定量PCR仪、扩增仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：人神经胶质瘤细胞U251细胞培养于添加10%的FBS、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640完全培养基中，于37 ℃、5%的CO2培养箱内传代培养，2 d更换1次培养基，选取生长状态良好的对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖能力：取对数生长期的U251细胞，按每孔1×104/ml浓度接种于96孔细胞培养板，设置100、200、400、600、800 μmol/L不同终浓度的橙皮素组、阴性对照组和空白对照组，每组设置5个重复孔，分别在培养24、48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，培养箱中继续培养细胞2 h，采用酶标仪测定450 nm波长下各孔的吸光度值(OD值)，计算细胞活力，实验重复3次。细胞活力=(橙皮素组OD值-阴性对照组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡：取对数生长期的U251细胞，以5×104个/孔的密度接种于6孔板中培养细胞制作细胞爬片，设置阴性对照组、200 μmol/L橙皮素组和400 μmol/L橙皮素组，处理24 h后，弃掉原培养液，加入800 μl的4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗涤3次，5 min/次，加入600 μl的Hoechst 33258染液，放入37 ℃摇床孵育20 min，PBS洗涤2遍，取出细胞爬片，置于载玻片上，滴加抗荧光猝灭封片液进行封片，每组随机选取5个视野在荧光显微镜下观察并采集图像。细胞核致密、深染或碎裂、块状即为阳性细胞(凋亡细胞)，细胞凋亡率=阳性细胞/总细胞×100%。实验重复3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡：取对数生长期的U251细胞，按每孔1×105/ml浓度接种于6孔细胞培养板，置于培养箱中培养至细胞密度约80%，更换培养基，设置阴性对照组、200 μmol/L橙皮素组和400 μmol/L橙皮素组，每组设置3个重复孔，继续培养24 h后，加入500 μl预冷的结合缓冲液重悬细胞，每孔加入5 μl的Annexin V-FITC染液，室温避光孵育15 min，再加入5 μl的PI染液，室温避光孵育5 min，采用流式细胞仪检测分析。实验重复3次。

1.2.5 细胞转染：取对数生长期的U251细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，待细胞融合度达到80%时，PBS洗涤细胞2次，更换无血清RPMI-1640培养基，将稀释好的Lipofectamine TM 2000转染试剂和siRNA-CHOP(或siRNA-NC)混合液加入24孔细胞培养板，转染48 h后检测转染效率，并进行后续实验。

1.2.6 qRT-PCR法检测CHOP mRNA相对表达量：取对数生长期的U251细胞，设置转染对照组(细胞转染阴性对照siRNA)、CHOP低表达组(细胞转染CHOP的特异性siRNA)、橙皮素加转染对照组(细胞转染阴性对照siRNA后采用200 μmol/L的HES处理)、橙皮素加CHOP低表达组(细胞转染CHOP的特异性siRNA后采用200 μmol/L的HES处理)、阴性对照组(常规培养细胞)、4-苯基丁酸组(5 mmol/L的4-PBA处理细胞)、橙皮素组(200 μmol/L的HES处理细胞)、橙皮素加4-苯基丁酸组(200 μmol/L 的HES和5 mmol/L的4-PBA共同处理细胞)。细胞处理24 h后，收集各组U251细胞，加入Trizol试剂，提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书进行RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR实验。引物序列：CHOP：上游序列为5’-TCTTCCTCCTCTTCCTCCTG-3’，下游序列为5’-CACTCTTGACCCTGCTTCTC-3’；Gapdh：上游序列为5’-CCACTCCTCCACCTTTG-3’，下游序列为5’-CACCACCCTGTTGCTGT-3’。qRT-PCR反应体系：cDNA模板1 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，2×Sybgreen PCR Master Mix 10 μl，ddH2O加至20 μl。qRT-PCR扩增程序：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行40个循环。以Gapdh为内参，根据2-△△Ct计算目的基因mRNA相对表达量。

1.2.7 Western blot检测凋亡相关、内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)相关蛋白表达量：取对数生长期的U251细胞，同“1.2.6”设置分组，同时设置200 μmol/L橙皮素组和400 μmol/L橙皮素组。细胞处理24 h后，收集各组U251细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，收集上清液，以BCA法进行蛋白定量，取一定量的蛋白溶液进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法将凝胶电泳分离的蛋白转移至PVDF膜上，用含5 %脱脂牛奶的缓冲液室温封闭1 h，TBST缓冲液洗膜，加入CHOP、GPR78、XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP、Gapdh一抗稀释液(1∶1000)，4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗稀释液(1∶5000)，室温孵育2 h，TBST缓冲液洗膜，用ECL试剂显影，以Gapdh作为内参，分析目的蛋白灰度值。

2 结 果

2.1 各组对胶质瘤U251细胞增殖活力的影响 CCK-8实验结果显示，与阴性对照组比较，经过不同浓度HES处理24、48 h的U251细胞增殖活力受到明显抑制，并呈剂量和时间依赖性，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表1。

表1 各组对胶质瘤U251细胞增殖活力的影响(%)

2.2 各组对胶质瘤U251细胞凋亡的影响 见表2(图1～3)。与阴性对照组比较，200 μmol/L橙皮素组和400 μmol/L橙皮素组细胞凋亡率均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组比较，200 μmol/L橙皮素组和400 μmol/L橙皮素组的凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP相对表达量均上调，差异有统计学意义(P<0.05)；且400 μmol/L橙皮素组各项蛋白相对表达量均高于200 μmol/L橙皮素组，差异有统计学意义(P<0.05)。图1中红色箭头表示凋亡细胞；图3应用Western blot法检测凋亡细胞的蛋白表达情况。

图3 各组细胞凋亡蛋白表达量

表2 各组对胶质瘤U251细胞凋亡的影响

图1 Hoechst 33258染色检测各组细胞凋亡(×200)

图2 Annexin V-FITC/PI 双染检测各组细胞凋亡

2.3 各组对胶质瘤U251细胞ERS相关蛋白表达的影响 4-苯基丁酸组的CHOP、GPR78、XBP-1、ATF6蛋白表达量和p-eIF2α/eIF2α与阴性对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。与阴性对照组比较，橙皮素组上述ERS相关蛋白表达量均上调，差异有统计学意义(P<0.05)；橙皮素加4-苯基丁酸组上述ERS相关蛋白表达量均低于橙皮素组，但高于4-苯基丁酸组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表3(图4)。

表3 各组对胶质瘤U251细胞ERS相关蛋白表达的影响

图4 各组胶质瘤U251细胞ERS相关蛋白表达

2.4 ERS参与HES诱导的胶质瘤U251细胞凋亡 4-苯基丁酸组的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量与阴性对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。橙皮素组上述凋亡蛋白表达量均高于阴性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。橙皮素加4-苯基丁酸组的上述凋亡蛋白表达量均低于橙皮素组，但高于4-苯基丁酸组(P<0.05)。见表4(图5)。4-苯基丁酸组的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量与阴性对照组比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。橙皮素组Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量均高于阴性对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)。橙皮素加4-苯基丁酸组的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白表达量均低于橙皮素组，但高于4-苯基丁酸组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

图5 ERS参与HES诱导的胶质瘤U251细胞凋亡

表4 ERS参与HES诱导的胶质瘤U251细胞凋亡

2.5 CHOP参与ERS介导的HES诱导胶质瘤U251细胞凋亡 见表5(图6)。qRT-PCR和West ern blot实验结果显示，CHOP的特异性siRNA转染细胞后，CHOP低表达组CHOP蛋白和mRNA表达量均低于转染对照组(P<0.05)。橙皮素加转染对照组CHOP蛋白和mRNA表达量均高于转染对照组(P<0.05)。橙皮素加转染对照组的凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP表达量均高于转染对照组(P<0.05)。橙皮素加 CHOP低表达组的CHOP蛋白和mRNA表达量、凋亡蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP表达量均低于橙皮素加转染对照组，但高于CHOP低表达组(均P<0.05)。

图6 CHOP参与ERS介导的HES诱导

表5 CHOP参与ERS介导的HES诱导胶质瘤U251细胞凋亡

3 讨 论

近年来，随着中药现代化的研究和发展，临床发现多数中药单体成分在恶性肿瘤的治疗中表现出明显优势，其中天然产物单体HES因具有抗炎、抗氧化和诱导细胞凋亡等作用在癌症治疗及预防中受到广泛关注[8-9]。Zhang等[10]研究表明，HES通过增加ROS激活线粒体途径，抑制胃癌细胞增殖，诱导凋亡，且其对胃癌细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性，同时，HES显著抑制胃癌细胞异种移植瘤的生长。Wu等[11]研究证实，HES通过增加细胞内活性氧类激活线粒体途径诱导食管癌细胞凋亡。Shirzad等[12]研究发现，在前列腺癌PC3细胞中，HES通过刺激IL-6和pSTAT3蛋白及基因表达诱导G0/G1期阻滞，进而抑制细胞增殖。

本研究CCK-8检测结果显示，HES可呈剂量及时间依赖性的抑制胶质瘤U251细胞增殖。Hoechst 33258 染色和Annexin V-FITC/PI 双染结果显示，HES能够有效提高胶质瘤U251细胞凋亡率。而在凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP的表达中，Western blot检测结果显示，HES能够上调Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、PARP、Cleaved-PARP蛋白的表达，并且随着HES浓度的增加，上述凋亡蛋白的表达量呈上升趋势，提示HES可通过调控凋亡相关蛋白的表达诱导胶质瘤U251细胞凋亡。

ERS持续发生时，会激活PERK、IRE1α、ATF6三条信号通路介导细胞凋亡，上调XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α关键分子蛋白的表达[13-14]。Tungkum等[15]研究表明，甲基苯丙胺(Methamphetamine，METH)介导的神经胶质细胞ERS中，METH通过增加ATF6、GRP78、CHOP、p-eIF2α、XBP-1基因和蛋白的表达诱导ERS相关的胶质细胞毒性，而褪黑素能够浓度依赖性地降低ATF6、GRP78、CHOP、p-eIF2α、XBP-1基因和蛋白的表达，从而降低METH毒性引起的ERS。异硫氰酸苄酯通过促进GRP78、XBP-1、ATF-6β表达激活ERS，从而诱导人脑胶质母细胞瘤GBM8401细胞凋亡[16]。上述研究表明，ERS相关因子GRP78、XBP-1、ATF6、eIF2α、p-eIF2α蛋白表达变化程度可反映ERS的发生情况。本研究证实4-PBA可抑制HES诱导的胶质瘤U251细胞ERS发生。此外，ERS参与了HES诱导的胶质瘤U251细胞凋亡；该结果与汪超等[17]的研究结果一致。

CHOP是ERS过程中非常关键的促凋亡因子，其在细胞正常状态下表达量极低，ERS激活后则会大量表达，特异性较强[18-19]。王巍松[20]研究报道，ERS中CHOP通路参与了脑胶质瘤的细胞凋亡。本研究结果提示HES诱导的ERS可能通过CHOP介导发生，并且CHOP通路参与HES诱导胶质瘤U251细胞凋亡的发生。

综上所述，HES可抑制胶质瘤U251细胞增殖，诱导细胞凋亡，其作用机制可能与ERS途径中CHOP信号通路的活化相关。