消积抑癌外敷方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长及Survivin蛋白表达的影响

郑 茜，刘远婷，丁甜甜，李 慧

(新疆医科大学第七附属医院中医科，新疆 乌鲁木齐 830000)

超过70%的肺癌患者确诊时已出现转移，无法接受手术治疗，而非手术治疗手段不良反应较多，肿瘤晚期患者合并多种基础病，免疫力低下，无法耐受放化疗，因而积极探寻新的有效治疗方法是目前研究重点[1-3]。中医学认为肺癌为本虚标实，正气虚损、阴阳失调、六淫之邪乘虚而入，引起肺脏功能失衡，宣降失司，气机不畅，从而血行受阻，津液输布不畅，津聚为痰，瘀阻脉络、痰气瘀毒胶结，发为肺部肿块。中医及中西医结合治疗肺癌多倾向于辨证辨病结合，扶正祛邪结合，改善患者症状、提高患者生存质量、稳定病灶、延长生存期及提高生存率，而关于中医作用于肺癌的机制目前研究甚少[4]。Survivin蛋白是以效应细胞蛋白酶受体cDNA在人体的基因组库杂交筛选中分离而得，参与肺癌的发生发展[5]。本研究拟分析消积抑癌外敷方对Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长、Survivin蛋白表达的影响，为临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物与细胞株：选取SPF级C57BL/6小鼠60只，雌鼠、雄鼠各30只，4～9周龄，体重19～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。Lewis肺癌细胞株购自中国生命科学院上海细胞库。

1.1.2 实验药物与试剂：消积抑癌外敷方组成如下：当归、川芎、乳香、没药、红花、赤芍、甲珠、丹参各30 g，五灵脂、透骨草、青黛、仙鹤草、丹皮、白鲜皮、蛇莓各60 g，莪术、苦参、山慈菇、商陆、延胡索、浙贝母、乌梅、蜂房各120 g，全蝎、虫、拳参各40 g，蜈蚣40条，冰片9 g。以上中药材由新疆医科大学第七附属医院中药房提供，将以上中药以破壁机研成细粉，将冰片溶入46°白酒制备成冰片酒，调和成膏状再消毒灭菌装瓶封制成外敷制剂，浓缩至生药含量为4.875 g/ml。其他试剂：胎牛血清(武汉博士德公司)，PBS(武汉博士德公司)，二抗PV-6001兔两步法试剂盒、DAB显色试剂盒(英国Invitrogen公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(江苏南京凯基生物有限公司)，免疫组化染色试剂中一抗Survivin(1∶50)兔抗鼠单克隆抗体、鼠抗人单克隆抗体Anti-β-actin、兔抗人单克隆抗体Anti-survivin(美国Santa Cruz公司)。

1.1.3 实验仪器：恒温CO2培养箱(Thermo公司)、低温高速离心机(3K-15型，德国Sigma公司)、显微镜(BX60型，日本Olympus)、病理切片机(RM2016型，上海徕卡仪器有限公司)、光谱扫描多功能酶标仪(ELX808IU型，美国Promega公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及建模：60只小鼠以随机数字表法分为四组，每组各15只，依次为对照组、消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组、消积抑癌高剂量组。建模：选择生长良好的对数生长期Lewis肺癌细胞，经胰酶消化，浓度调整为1×107个/ml后均经小鼠右侧腋部皮下接种0.2 ml。在建模8 d后，可触及皮下结节、瘤长至100～300 mm提示建模成功[6]。

1.2.2 给药方法及取材：建模后，对照组0.80 ml/20 g0.9%氯化钠溶液调和的面糊外敷于瘤体表面、加热至30 ℃，3次/d，30 min/次。消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组、消积抑癌高剂量组分别予以0.20 ml/20g、0.40 ml/20g、0.80 ml/20g的消积抑癌外敷方外敷于瘤体表面、加热至30 ℃，3次/d，30 min/次。各组均连续干预30 d后以颈椎脱臼法将小鼠处死，同时剥离各组小鼠瘤组织。

1.2.3 HE染色：取瘤旁及瘤体组织，4%中性甲醛固定后的标本经脱水、透明、浸蜡与包埋后，制成蜡块。以Leica RM2235石蜡切片机进行连续切片，厚度5 μm，切片经脱蜡后予以常规的苏木精-伊红染色(HE染色)，光学显微镜下观察组织学形态并拍照记录。

1.2.4 抑瘤效果评估：取出完整的肿瘤组织后称重，计算抑瘤率。抑瘤率为对照组与观察组的平均瘤重差值占对照组平均瘤重百分比。

1.2.5 胸腺指数、脾脏指数：在剥离瘤体后，取小鼠胸腺、脾脏组织，称重。胸腺指数=10×胸腺重量(g)/鼠重(g)、脾脏指数=10×脾脏重量(g)/鼠重(g)。

1.2.6 肺转移灶个数：将双肺完整取出后，应用苦味酸固定，镜下对双肺表面转移灶数进行统计。

1.2.7 免疫组化法测定Survivin蛋白表达水平：经SP免疫组化法对肿瘤组织Survivin蛋白表达水平进行测定。取新鲜肿瘤组织，以10%中性甲醛固定24 h后切块、脱水、石蜡包埋，以切片机切片，每蜡块连续切片3张，厚度4～5 μm，切片脱蜡水洗后高压热修复，以3%H2O2阻断过氧化酶，PBS洗涤3 min×3次，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗涤3 min×3次，DAB显色2 min，苏木素复染，透明后封片镜检。严格依据半定量评分系统评定染色效果[7]，着色强度、阳性细胞所占百分比两项乘积<3分为阴性(-)，≥3分为阳性(+)，3～5分为弱阳性(+)，6～9分为中阳性()，>9分为强阳性表达()。

1.2.8 Western blot法测定Survivin蛋白表达：取新鲜肿瘤组织并移入无菌的离心管，1000 r/min、离心5 min，以4 ℃预冷的PBS洗涤2次，将残余液体吸干后每瓶细胞加300 μl细胞裂解液，冰上摇匀30 min，待细胞充分裂解后收集到不含RNA酶的1.5 ml预冷离心管，取上清应用BCA法定量，采用PVDF膜进行湿转，5%脱脂奶粉行免疫印迹、封闭、孵育，将残留的一抗洗掉后加二抗，室温摇床1 h，洗去膜上残留二抗，避光滴加配制好的ECL化学发光A、B混合试剂，经数字凝胶成像系统对PVDF膜进行扫描，按照内参条带测出目的条数，计算相对表达量。相对表达量=目的条带灰度值/内参灰度值。

2 结 果

2.1 瘤旁及瘤体组织的HE染色结果 HE染色结果(图1)可见瘤旁组织的肺泡未增厚，腺圈不明显；瘤体组织见肺泡壁明显增厚，观察到肺腺癌的病理特征，腺圈明显。

2.2 各组小鼠体重、瘤重、抑瘤率比较 各组小鼠体重两两比较，差异无统计学意义 (均P>0.05)。消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组、消积抑癌高剂量组小鼠瘤重均低于对照组，且消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组、消积抑癌高剂量组小鼠瘤重依次降低，而抑瘤率逐渐增加，三组组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠体重、瘤重、抑瘤率比较

2.3 各组小鼠胸腺指数、脾脏指数比较 消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组、消积抑癌高剂量组胸腺指数、脾脏指数均高于对照组(P<0.05)。消积抑癌高剂量组胸腺指数高于消积抑癌低剂量组、消积抑癌中剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)；消积抑癌高剂量组、消积抑癌中剂量组小鼠脾脏指数高于消积抑癌低剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠胸腺指数、脾脏指数比较(mg/10 g)

2.4 各组小鼠肺转移灶个数比较 对照组肺转移灶平均(14.23±1.56)个>消积抑癌低剂量组(10.12±1.35)个>消积抑癌中剂量组(8.49±0.88)个>消积抑癌高剂量组(6.43±0.67)个。消积抑癌不同剂量组间比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。

2.5 各组小鼠Survivin蛋白表达比较 对照组Survivin蛋白积分、Survivin蛋白阳性率及Survivin蛋白相对表达量均高于不同剂量的消积抑癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。消积抑癌高剂量组Survivin蛋白积分、Survivin蛋白阳性率及Survivin蛋白相对表达量最低。见表3(图2、3)。

表3 各组小鼠Survivin蛋白表达比较

A：对照组；B：消积抑癌低剂量组；C：消积抑癌中剂量组；D：消积抑癌高剂量组

A：对照组；B：消积抑癌低剂量组；

3 讨 论

肺癌为临床常见的恶性肿瘤，肺癌的发病率和病死率逐年攀升[8-9]。手术、放化疗为肺癌的主要治疗方案，近年来中医药治疗逐渐受到关注。中医认为肺癌以肺脾虚为本，痰瘀为标，久病及肾；肺癌证型主要有气滞、血瘀、痰湿、热毒等，依据临床表现可归于“咳嗽”“痰饮”“息奔” “肺积” “咯血” “肺花疮” “胸痛”等范畴[10]。蒋艳玲等[11]发现，中药化痰消瘤方能对Lewis荷瘤小鼠发挥抑瘤作用，并对抗肺癌转移，且以高剂量组疗效最显著，其作用机制可能是上调肿瘤E-cad表达，导致肿瘤细胞间黏附增加，使其向周围组织侵袭力减轻，且可显著下调肿瘤细胞的表达，减轻肿瘤细胞与基质间的黏附，使肿瘤细胞侵袭及转移受到抑制。Survivin为凋亡基因，其能抑制凋亡，调节细胞分裂，于多种恶性肿瘤中高表达，而正常组织中几乎不表达[12]。李兴培教授提出治疗肺癌的临床方案为以扶正消积汤内服联合消积抑癌外用方，或单用消积抑癌外用方，与西医放、化疗有机结合，可缓解患者症状并稳定病灶，提高放化疗效果，使患者带瘤生存水平提升，增强机体的免疫功能，减轻放化疗所致消化系统、血液系统的不良反应。因此本研究建立Lewis肺癌荷瘤模型，分析消积抑癌方外敷治疗的抑瘤作用及其作用机制，为后续临床治疗提供理论依据。

本次通过建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，分析本院消积抑癌外敷方对其肿瘤生长的影响，从结果来看Lewis肺癌荷瘤小鼠予以消积抑癌外敷方后可起到抑制肿瘤生长、减少肿瘤转移的作用。此外本次研究发现，随消积抑癌外敷方给药剂量增加，Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重逐渐减少，抑瘤率逐渐增加，说明其治疗效果呈剂量依赖性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长，这与周婷婷等[13]的研究结论吻合。

本次采用的消积抑癌外敷方由新疆名中医李兴培教授创制，李教授论治肿瘤的辨证思想融合了金元时期张从正和张元素的学术主张。张从正认为：“盖邪未去而不可言补，补之则适足资寇”“损其有余所以补不足也”。张元素认为：“养正积自除”。故李兴培教授取两家之长，以“攻补兼施”为指导思想，创制了扶正消积汤(内服方)和消积抑癌外用方，内服“补其不足”，外敷“损其有余”。消积抑癌外敷方中多选用虫类药以通络消积、以毒攻毒；选用活血破瘀消积药以清瘀毒，如当归、川芎、乳香、没药等；选用清热解毒散结药物如苦参、山慈菇、商陆等[8]；辅以冰片、白酒的辛散透皮，引药到达病所；诸药配伍可发挥清热解毒、活血消积、以毒攻毒等功效[14-16]。现代药理研究表明当归[17]、川芎[18]可活血、补血，抑制Lewis小鼠移植瘤生长，其作用机制可能是直接作用于癌细胞，发挥抗血管生成作用；红花中红花黄色素可较好缓解及保护呼吸系统相关疾病[19]；莪术[20]、赤芍[21]、丹参[22]能较好抑制肿瘤组织转移、血管生成，诱导肿瘤细胞凋亡，并能调节机体免疫功能、抑制肺间质纤维化。

研究结果发现消积抑癌外敷方高剂量组的胸腺指数、脾脏指数较消积抑癌外敷方低剂量组、消积抑癌外敷方中剂量组高，消积抑癌外敷方中剂量组脾脏指数高于消积抑癌外敷方低剂量组，这与谢英瑛[16]的报道结果相似，说明消积抑癌外敷方可提高Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官指数，保护小鼠免疫功能，增强肿瘤的免疫应答水平，且呈剂量依赖性，这可能和中药活性成分发挥药理作用有关系，其具体机制可在后期研究中进一步探讨。

Survivin为最强的凋亡抑制因子，也是唯一和细胞周期有密切关系的IAP家族成员，通过BIR重要序列抑制Caspase依赖的细胞凋亡途径；Survivin也可促进p21与线粒体中Caspase-3结合，而明显抑制Caspase活性，促进细胞分裂，抑制细胞凋亡[23-24]。本研究中对照组Survivin蛋白积分、阳性率与相对表达量均高于消积抑癌外敷方各剂量组，其中消积抑癌外敷方高剂量组的Survivin蛋白积分、阳性率与相对表达量最少，表明消积抑癌外敷方可抑制Lewis小鼠Survivin蛋白表达。李巧玲[25]发现，爱康方(组方：生薏苡仁、通关藤、金荞麦、桃仁、紫珠叶、臭壳虫、花蕊石、三七、血余炭)对人肺腺癌A549、小鼠Lewis细胞内的Survivin蛋白及基因表达有一定影响。此外也有研究发现Survivin是细胞周期调节基因，其表达和肺癌的癌细胞周期密切相关，半衰期仅30 min，于细胞周期G2M期有一定表达，而随后G1期的mRNA及蛋白表达水平快速下降，Survivin在肿瘤细胞中表达水平升高，抑制癌细胞凋亡，促进癌细胞侵袭周围组织，导致转移[26]。但本次未对Lewis荷瘤小鼠的细胞周期进行研究，关于Survivin蛋白对Lewis肺癌荷瘤小鼠的细胞周期调控作用值得进一步探究。

综上所述，消积抑癌外敷方能较好地抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长及Survivin蛋白表达，且呈剂量依赖性。