他克莫司对嘌呤霉素损伤的肾小球足细胞重组人帕金森蛋白7表达的影响

谭俊杰 于生友 张瑶 郝志宏 于力

（广州医科大学附属广州市第一人民医院儿科，广东广州 510180）

肾小球硬化是由于多种慢性肾脏疾病发展的复杂病理过程，临床上多种因素都可引起肾小球足细胞结构和功能的改变，包括感染、药物、毒物、缺血、缺氧、代谢等，引起肾小球足细胞活化、增生、炎性细胞浸润、凋亡等损伤。当肾小球足细胞出现损伤后，足突的融合和裂孔隔膜消失，导致肾小球滤过屏障功能受损，出现蛋白尿。随着各种细胞因子及炎症因子释放、免疫复合物沉积，导致大量的细胞外基质积聚，进而出现肾小球硬化病理改变［1-2］。肾小球足细胞是肾脏的固有细胞，其损伤后难以修复，临床上通过多个靶点治疗可改善肾小球滤过膜分子结构，以减轻蛋白尿或者达到治愈目的，延缓肾小球硬化的进程［3］。他克莫司（tacrolimus，FK506）属于经典的钙调磷酸酶抑制剂，通过免疫抑制T淋巴细胞的活化与增殖作用，以及非免疫抑制作用保护肾小球足细胞，其确切机制仍不十分清楚［4］。重组人帕金森蛋白7（Parkinson's disease 7，Park7）基因最初是在1997年Nagakubo等［5］发现的癌基因，随后在2003年，证实是帕金森病的致病基因［6］。Park7基因广泛存在于脑、肝脏、肾脏、骨骼肌及生殖器官，参与基因转录调控、信号转导途径，参与氧化应激、线粒体自噬途径、分子伴侣等生物学作用，包括通过清除活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）产生直接抗氧化活性及Park7/Nrf2信号通路激活内源性抗氧化作用等［7］。Park7与肾脏之间存在一定的关系，但研究报道比较少，国外曾有研究报道肾小球系膜细胞的Park7表达在高糖刺激下呈增高趋势，并以时间依赖性方式与Akt磷酸化密切相关［8］。本课题组前期研究表明，嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）可以抑制足细胞突触蛋白CD2AP、TRPC6、nephrin、podocin等表达，以时间和浓度依赖性方式诱导足细胞凋亡［9-11］。那PAN损伤足细胞究竟对Park7的表达是否有影响，FK506是否可通过参与足细胞Park7的表达，从而达到保护足细胞的作用？

本研究通过体外建立PAN诱导小鼠肾小球足细胞（mouse podocyte clone 5，MPC-5）损伤模型［12］，探讨研究PAN对MPC-5凋亡及Park7 mRNA和蛋白表达的影响，以及FK506对MPC-5损伤的保护机制，目的进一步探讨Park7参与肾小球足细胞损伤及保护的作用，从而为协助临床治疗肾脏疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 MPC-5培养

MPC-5购买于北京北纳创联生物技术研究院，用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素双抗、0.2%γ-干扰素的RPMI1640培养液培养，在33℃、5%二氧化碳条件下，诱导MPC-5进行增殖。每隔1～2 d换液1次，待细胞融合至75%～85%，用含EDTA胰蛋白酶的消化液消化传代后把培养温度调至37℃，培养10～14 d后诱导MPC-5分化成熟，把分化成熟的MPC-5接种至6孔板中，待细胞融合至80%～90%后，用不含血清及抗生素的纯RPMI1640培养液饥饿细胞12 h，使细胞生长同步，再进行分组、加药处理。

1.2 实验分组

实验分为3组：对照组（RPMI1640培养液培养），PAN组［向培养液中加入PAN（浓度50 mg/L），诱导MPC-5损伤模型［12］］，FK506组［向培养液中加入PAN（浓度50 mg/L）和FK506（浓度5 mg/L）［13］］。PAN购自美国APExBIO公司，FK506购自浙江奥默生物医药有限公司。分别于3个时间段（12、24、48 h）使用倒置显微镜观察MPC-5的形态结构，并收集MPC-5进行后续实验。

1.3 倒置显微镜观察MPC-5形态结构变化

用37℃PBS液漂洗各组细胞3次，倒置显微镜（×200）下观察并拍照记录，运用Image J图像处理图片。

1.4 流式细胞术检测MPC-5凋亡率

预冷PBS漂洗MPC-5后，加入不含乙二胺四乙酸胰酶消化细胞，收集悬浮细胞于室温离心5 min（1 000 r/min），去上清，预冷PBS冲洗2次，收集1×105～5×105个细胞，加入Binding Buffer 400μL重悬细胞，转移入流式管，加入Annexin V-FITC 10μL和PI 5μL后室温静置避光反应10 min，采用流式细胞仪检测并使用FlowJo-V10软件分析，实验独立重复3次。

1.5 实时荧光定量PCR检测Park7 mRNA相对表达量

采用TRIzol protocol提取总RNA，按RNA gents Total RNA Isolation System（TAKARA公司）操作说明进行逆转录及Real-Time PCR反应。Park7上游引物：5'-AGTCACTACAGCTACTCAGAGA-3'，下游引物：5'-AATGGCTAGTGCAAACTCAAAG-3'，片段长度126 bp；内参β-actin上游引物：5'-TACCCCCAATGTGTCCGTC-3'，下游引物：5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'，片 段 长度171 bp。引物的设计与合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。Real-Time PCR反应体系（20.0μL）：SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0μL，cDNA 2.0μL，上下游引物各1.0μL，ddH2O 6.0μL。Real-Time PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性10 s，60℃退火20 s，共40个循环。最后得出标准曲线和线性方程，用双标准曲线法计算，以Park7与β-actin内参基因的比值表示Park7 mRNA的相对表达量。实验独立重复3次。

1.6 Western blot检测Park7蛋白表达

PBS液漂洗各组MPC-5两次，吸掉PBS液后加入RIPA细胞裂解液，置于冰上摇床裂解30 min，并吹打细胞裂解。按照BCA法测定总蛋白浓度并调平，100℃、10 min使蛋白变性。制备SDS凝胶，每孔加20μL样品，转移至PVDF膜。室温5%脱脂奶粉摇床封闭2 h，滴加Park7一抗（1∶500，英国Abcam公司）在4℃摇床孵育过夜，滴加二抗（1∶1 000）在室温摇床孵育1 h。加入1 mL的ECL化学发光剂，曝光并拍照，曝光图片采用Image J图像扫描并分析蛋白条带灰度值，以Park7蛋白条带与内参GAPDH蛋白条带的灰度值的比值表示Park7蛋白相对表达量，实验独立重复3次。

1.7 免疫荧光检测Park7蛋白分布

分组培养分化MPC-5并爬片，多聚甲醛固定8 min，Triton-100室温破膜5 min，用5%BSA在37℃封闭1 h。向分组细胞爬片滴加Park7一抗（1∶500，英国Abcam公司），4℃湿盒过夜。PBS洗涤3次后加入二抗（1∶200），37℃孵育反应1 h，采用DAPI室温染核，PBST清洗多余DAPI 3次，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察采集各组MPC-5的图像，实验独立重复3次。

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察各组MPC-5的形态变化

分别在12、24、48 h于倒置显微镜（×200）下观察各组MPC-5的形态结构。各时间点对照组细胞体积较大，形状一致，足突自细胞体伸出，相邻细胞间连接紧密，结构清晰，胞浆丰富，细胞核明显。PAN刺激后，PAN组细胞12 h时较对照组相比，可见细胞体积缩小，相邻细胞间连接疏松，足突回缩；24 h时细胞体积缩小，足突明显回缩；48 h时MPC-5缩小最为明显，细胞分布稀疏，可见较多破碎细胞。各时间点FK506组细胞胞体面积较PAN组胞体面积大，且足突结构较明显，数量较多，细胞之间连接紧密度也较PAN组好转。见图1。

图1 各组不同时间点MPC-5形态变化（倒置显微镜，×200） 对照组MPC-5在各时间点足突自细胞体伸出，结构清晰，胞浆丰富，细胞核明显，形态一致。PAN组MPC-5在各时间点可见细胞体积缩小，相邻细胞间连接疏松，足突回缩，有较多破碎细胞。FK506组MPC-5在各时间点仍可见较多足突，细胞间连接紧密度也较PAN组好。

2.2 各组MPC-5凋亡率的变化

对照组中12、24、48 h MPC-5凋亡率均处于较低水平。PAN组中，12 h和24 h MPC-5的凋亡率明显高于对照组，48 h MPC-5的凋亡率较对照组增加更为明显（P<0.05）。FK506组中，12、24、48 h MPC-5凋亡率均低于PAN组，但仍均高于对照组（P<0.05）。见表1和图2。

图2 流式细胞仪检测各组不同时间点MPC-5凋亡率 Q1为PI（+），AnnexinⅤ（-）：机械损伤细胞；Q2为PI（+），AnnexinⅤ（+）：晚期凋亡或死细胞；Q3为PI（-），AnnexinⅤ（+）：早期凋亡细胞；Q4为PI（-），AnnexinⅤ（-）：正常活细胞。其中Q2和Q3反映MPC-5凋亡率。

表1 各组各时间点MPC-5凋亡率比较（n=3，±s，%）

表1 各组各时间点MPC-5凋亡率比较（n=3，±s，%）

注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与PAN组比较，P<0.05。

组别对照组PAN组FK506组48 h 14.8±1.7 40.7±2.3a 23.9±2.0a,b 24 h 11.3±1.6 25.4±1.8a 19.2±1.7a,b 12 h 10.0±1.4 17.4±1.7a 15.8±1.3a,b F值P值21.425 0.002 51.992<0.001 128.051<0.001

2.3 各组MPC-5 Park7 mRNA相对表达量的变化

荧光定量PCR结果显示，对照组中12、24、48 h的Park7 mRNA表达水平较低。PAN组12、24、48 h的Park7 mRNA表达水平均较对照组增高（P<0.05）。FK506组中，Park7 mRNA的表达水平在12、24、48 h时均低于PAN组（P<0.05），且与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组不同时间点Park7 mRNA相对表达量比较（n=3，±s）

表2 各组不同时间点Park7 mRNA相对表达量比较（n=3，±s）

注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与PAN组比较，P<0.05。

组别对照组PAN组FK506组48 h 1.88±0.12 3.86±0.15a 2.03±0.12b 12 h 1.26±0.14 1.76±0.16a 1.57±0.18b 24 h 1.53±0.16 2.32±0.11a 1.71±0.19b F值P值7.388 0.024 20.907<0.001 213.211<0.001

2.4 各组细胞Park7蛋白表达情况

Western blot结果显示：对照组中12、24、48 h的Park7蛋白表达水平较低。PAN组12、24、48 h的Park7蛋白表达水平均较对照组显著增高（P<0.05）。FK506组中，Park7蛋白表达水平在12、24、48 h时均较PAN组下降（P<0.05）。见图3，表3。

图3 Western blot检测各组不同时间点Park7蛋白相对表达电泳图 1、4、7为对照组，2、5、8为PAN组，3、6、9为FK506组。

表3 各组各时间点Park7蛋白相对表达水平比较（n=3，±s）

表3 各组各时间点Park7蛋白相对表达水平比较（n=3，±s）

注：a示与对照组比较，P<0.05；b示与PAN组比较，P<0.05。

组别对照组PAN组FK506组48 h 0.471±0.016 0.788±0.034a 0.557±0.020b 12 h 0.184±0.026 0.483±0.037a 0.260±0.031b 24 h 0.337±0.023 0.629±0.041a 0.391±0.016b F值P值98.727<0.001 100.429<0.001 166.500<0.001

2.5 免疫荧光检测各组蛋白分布结果

免疫荧光染色显示：对照组Park7主要分布于细胞膜表面，少量均匀地分布在细胞质中，并且在细胞核周围可见到颗粒状分布。PAN刺激后，Park7蛋白在细胞膜上表达较对照组明显增多，在细胞质内分布亦明显增多，呈不均匀团状分布，荧光强度明显增强。随着时间延长，在24 h、48 h后Park7蛋白表达明显增多，呈密集团状分布，荧光强度增强更加明显。FK506干预后Park7在各时间点均匀地分布在细胞膜中，细胞膜中的分布较PAN组减少，荧光强度较PAN组降低。见图4。

图4 各组各时间点Park7蛋白免疫荧光表达和分布（×400） 对照组Park7蛋白主要分布于细胞膜表面，少量均匀地分布在细胞质中，并且在细胞核周围也可看到颗粒状分布。PAN组Park7蛋白在细胞膜上表达较对照组明显增多，在细胞质内分布亦明显增多，呈不均匀团状分布，荧光强度明显增强。FK506组Park7蛋白表达分布较PAN组减少，荧光强度较PAN组降低。

3 讨论

肾小球滤过屏障的重要组成部分为基底膜、血管内皮细胞及足细胞，可阻止白蛋白从血液中进入尿液，避免蛋白丢失，其完整性遭到损伤可导致肾脏病变。在PAN建立肾小球足细胞损伤经典模型中，PAN直接损伤细胞分子结构及功能蛋白的表达，同时使肾小球固有细胞产生和释放ROS而间接破坏肾小球滤过膜，最终导致肾小球损伤［14］。FK506是一种经典钙调磷酸酶抑制剂，体外实验显示通过抑制淋巴细胞转录因子和核因子κB活化T细胞核因子的活性，进一步抑制了炎症 细 胞 因 子（IL-2、IL-6和IL-8）的 分 泌［15］。Rosenstock等［16］和Shen等［17］研究表明，FK506可调节Bax、Bcl-2、caspase-3及Bad等凋亡因子的表达，减少足细胞凋亡，并可通过增加膜蛋白podocin、突触足蛋白等的表达，稳定细胞骨架，同时抑制PAN诱导的p38/JNK信号传导，从而达到保护足细胞作用。

Park7基因位于染色体1p36.2-p36.3，属于Thij/PfPI家族，在进化上高度保守，人体和小鼠的基因相似，大约24 kb。Park7基因在人体中广泛存在于大脑、肝脏、肾脏及卵巢等器官，近年来发现Park7参与肾脏疾病越来越受到研究者的重视［18］。Cuevas等［19］证实在高血压肾病中，调节Park7在肾小管上皮细胞的表达，直接影响ROS的产生。Andres-Mateos等［20］发现Park7作为蛋白酶有清除线粒体过氧化氢的作用，稳定线粒体自噬功能。位红兰等［21］研究表明在肾脏纤维化实验中，Park7的高表达可抑制第10号染色体缺失性磷酸酶和张力蛋白同源物的转录及翻译，并改变其在细胞内的分布，还可促进PI3K/AKt通路的活化，说明当有效抑制Park7的表达时可以延缓肾脏纤维化。沈孜颖等［22］研究证实高糖可导致氧化应激增强，导致抗氧化应激损伤Park7/Nrf2重要通路失活，从而导致肾小管上皮细胞损伤的病理生理过程。Wang等［23］研究表明过表达Park7可降低Nrf2蛋白的泛素化，稳定Nrf2的蛋白表达水平，下调Park7则会降低Nrf2蛋白的稳定性。以上研究均提示Park7是维持肾脏正常生理功能的重要成分之一。

本研究在PAN刺激MPC-5后，随着干预时间的变化，PAN引起足细胞明显损伤，细胞结构和功能受损。此外，PAN组随着干预时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，可能与促细胞凋亡相关因子的活性增强密切相关。PAN直接损伤及通过间接信号途径参与破坏足细胞形态结构及其分子功能，导致细胞凋亡率升高，损伤肾小球结构完整性，可引起蛋白尿。PAN刺激足细胞后，可见Park7 mRNA和蛋白表达上调。当PAN刺激足细胞时引起细胞核内Park7磷酸化失活，活性Park7含量的下降引起代偿性mRNA表达增高，同时由于外源性细胞质中的活性Park7减少，使得其抗氧化能力也随之下降，无法及时清除ROS，异常积累的ROS可导致线粒体发生肿胀，细胞膜通透性增高，细胞进一步出现明显损伤。免疫荧光结果显示经PAN刺激后，Park7分布增多，呈密集团状分布。我们考虑，当PAN刺激足细胞发生剧烈氧化反应时，胞浆中的Park7蛋白可移位至线粒体中，并形成二聚体，免疫荧光明显增强［24］。在本研究中，PAN组足细胞Park7 mRNA及蛋白的表达变化是一致的，符合mRNA转录及蛋白翻译的调控机制。随着时间的推移，在PAN刺激及氧化应激反应持续状态下，Park7失代偿性升高，进而导致足细胞损伤加重。

我们观察FK506干预损伤的足细胞，其损伤较PAN组减轻，细胞形态结构均更为清晰，细胞间连接较PAN组紧密，细胞凋亡率也较PAN组下降，存活的足细胞数量增加，提示FK506对足细胞的形态结构及功能具有保护作用，有效降低足细胞损伤，提高足细胞的存活率。FK506干预后，Park7 mRNA及其蛋白表达均明显低于PAN组，说明FK506可通过改善Park7 mRNA的转录及蛋白翻译，稳定细胞Park7的表达，减轻PAN对足细胞的损伤，协助维持正常的足细胞mRNA转录和蛋白翻译功能。与此同时，FK506干预后，免疫荧光结果显示Park7在细胞膜内分布较PAN组减少，细胞核周围可见颗粒状分布，较PAN组明显减轻，与Western blot结果相一致，也证实FK506可有效拮抗PAN诱导的足细胞损伤，稳定Park7蛋白的表达。综合上述结果我们考虑可能的作用机制为：PAN可通过激活p38/MAPK信号通路，引起足细胞中促凋亡蛋白的高表达，而FK506参与p38/MAPK信号通路，有效降低p38/MAPK蛋白的水平，从而抑制下游相关基因的表达［17］。另外，FK506可通过调节Bax、caspase-3等蛋白的表达，减轻PAN引起线粒体功能障碍，从而使线粒体自噬维持在稳定的水平［25］。

综上，FK506通过非免疫机制发挥保护足细胞的功能，有效抑制PAN损伤足细胞，降低足细胞Park7表达。下一步研究将阐明FK506干预足细胞的具体分子通路，并探讨Park7与足细胞突触蛋白之间的调控作用。