基于SNP标记的荷包红鲤与兴国红鲤鉴别研究

王彦云 王济世 刘晓夏 赵璐瑶 赵汝婷 杨曙明

摘 要：兴国红鲤和荷包红鲤是宝贵的红鲤品种，作为优良杂交亲本，广泛应用于品种改良和新品种的选育。由于形态相近、差异较小，在选择杂交亲本的过程中，极易发生两种红鲤的混淆，影响新品种的养殖经济效益。通过阅读参考文献，使用数据库位点挑选和性状基因位点挑选，获得了8个SNP候选标记，理论上使用7个SNP标记，即可实现两种红鲤的鉴别，且鉴别错误率为6.30E-05，这对以两种红鲤为杂交亲本的新品种选育及养殖效益的提升意义重大，也有利于两种红鲤的种质资源保护。

关键词：兴国红鲤;荷包红鲤;SNP标记;鉴别

红鲤是极为重要的鱼类育种材料之一，兴国红鲤和荷包红鲤是中国江西省两个传统的地方鲤品种，其既可观赏、又可食用，具有极高的经济价值[1]。由于具有生长速度快、繁殖率高、抗逆性强和杂交亲和力强等特点，两种红鲤被广泛应用于品种改良和新品种的选育[2-3]。我国鲤鱼养殖品种主要为德国镜鲤选育系、荷包红鲤抗寒系、豫选黄河鲤新品系等“三大系列”，其中，荷包红鲤抗寒系是以荷包红鲤为杂交亲本，通过系统选育得到的一系列生长性状更优、抗逆性更强鲤鱼新品种。此外，兴国红鲤在育种方法亦有诸多应用，例如，丰鲤、芙蓉鲤、兴德鲤等均为以兴国红鲤为亲本杂交选育而得的优良鲤鱼品种。到目前，通过这两种红鲤鱼和其他当地普通鲤鱼品种杂交，已经繁育出了10多个优良的杂交品种，对促进我国水产养殖生产的发展起到了很大的作用。两种红鲤形态特征较为相似，这给选育工作者选择杂交亲本造成了困难;同时，由于荷包红鲤具有更高的经济价值，也会有兴国红鲤假冒荷包红鲤之名销售的情况。因此，对两种红鲤的鉴定十分必要，这对在鲤鱼新品种资源的开发和鲤鱼养殖产业经济效益的提升具有重大的意义[2，4]。兴国红鲤与荷包红鲤均产自江西省长江中下游水域，从形态学角度来看，荷包红鲤体粗短，体色呈纯红或橘橙色，体长/体高为2.0～2.3，而兴国红鲤呈纺锤形，体红色，体长/体高为2.55～3.55[5];从核型学特征来看，二者染色体组型一样[6]。两种红鲤形态上虽有差别，但这种差别属于一个种内不同品种或生态种群间的细微差异[7]。由于地理因素和人为因素的影响，两个品种极易混淆，这既不利于杂交亲本的选择，也不利于两种红鲤种质资源的保护。单核苷酸多态性（SNP）是基因组水平上单个碱基的变异所引起的DNA序列的多态性，属于第三代遗传标记技术。由于SNP标记具有存在广泛、富有代表性、遗传稳定性以及易实现分析的自动化等特点，被广泛应用于种质鉴定、产品溯源等方面[8-11]。

1 材料与方法

1.1 DNA样品的准备

实验鱼分别取自国家级婺源荷包红鲤良种场和兴国县，两个红鲤品种各50条，各样品取自不同池塘，相互之间不存在亲属关系。所有样品均通过国标方法进行鉴定。所有样本都用于SNP标记的挑选。DNA样本的提取使用组织DNA提取试剂盒，提取后的样本使用紫外分光光度计（NanoDrop 2000c）测定浓度和纯度，DNA样本的完整性采用电泳的方法考察。符合标准的样品于-20 ℃储存备用。

1.2 多态性位点验证

位点的挑选基于之前研究获得的大量鲤多態性位点，所选位点尽可能分布在鲤鱼50条染色体鲤鱼性状基因上[12-17]，且位于基因非编码区[18-20]。挑选后的位点使用二代测序技术进行基因分型，二代测序由上海翼合应用生物技术有限公司提供支持。

1.3 统计分析

各位点在样本群体中的等位基因频率、基因型频率通过直接计数方式获得[21]。偶合概率（MP）计算公式为式（1）[22]：

MP=∏mk=1∑ni=1（P2ki）+∑ni=1∑nj=i+1（2pkipkj）2（1）

式（1）中，m-位点数、n-位点k等位基因数、pki（j）-位点k等位基因i、j等位基因频率。

2 结果与分析

2.1 多态性位点验证

通过大量位点的挑选，共得多态性位点20个，位点基因名称、染色体、位置和突变信息如表1。对两个品种红鲤共计100个样本，测定上面20个多态性位点基因型，分型后对20个多态性位点在不同红鲤品种中的基因型以及等位基因频率进行分析，发现有一部分位点在两个红鲤品种间存在较大多态性差异，这些位点在一个红鲤品种中兼具三种基因型，而在另一红鲤品种中只有一种纯合子基因型。我们共获得这样的候选标记11个，用于2个红鲤品种的鉴别。由表2可知，11个候选标记均与鲤鱼头部和体型等性状基因相关，其中，与头部、体高性状基因相关的标记就有一半，如SNP14、SNP15、SNP16与鲤鱼头长性状基因有关，SNP17、SNP18与鲤鱼眼径、体高和体厚等性状基因相关，这与明俊超等[23]对6 个不同鲤群体的形态差异分析结果一致，荷包红鲤和兴国红鲤群体在形态上存在一定差异和分化，主要体现在体型、头部和眼部特征上。

2.2 两种红鲤鉴定效果评估

由表3可知，所有11个候选多态性位点，除SNP14、SNP16和SNP18外，其余8个位点在兴国红鲤中均表现出较高的多态性，兼具两种纯合子和一种杂合子，而在荷包红鲤中保守，只有一种纯合子。这8个标记均能用于两种红鲤的鉴定，若检测这些位点上黄河鲤特有的等位基因，则单个标记使用时的品种耦合概率（BMP）如附图所示。所有8个标记单独使用的品种耦合概率（BMP）在0.040～0.735不等，以耦合概率最小的标记SNP5为例，荷包红鲤群体只有一种纯合子“AA”，而兴国红鲤群体兼具两种纯合子“AA”、“GG”以及杂合子“AG”，即等位基因“G”为兴国鲤所特有。若未知样品于标记SNP5上检测出“G”等位基因，则判定样品为兴国红鲤，耦合概率为0.04，即单独使用SNP5标记对两种红鲤进行个体鉴定，每鉴定100个兴国鲤个体，仅有4个被误判为荷包红鲤。

在实际应用中，仅使用单个标记远不能满足品种鉴定时群体数量和准确度的要求，为了达到更好的鉴定效果，通常需要增加标记的数目。本研究通过鉴定只在兴国红鲤中出现的等位基因来对两个红鲤品种进行鉴定，通过多个标记共同使用，降低品种耦合概率。按照区分能力大小对标记进行排序，并计算不同数量标记组合时品种鉴定耦合概率。从表3我们可以看到，随着标记数目的增加，两个品种红鲤鉴定的耦合概率值在不断下降，当使用区别能力最好的6个SNP标记SNP5、SNP17、SNP15、SNP13、SNP7、SNP19时，MP值仅为万分之1.23，两种红鲤鉴定错误的概率不超过万分之1.23;当使用全部7个标记时，MP值仅为10万分之6.30，即两种红鲤鉴定错误的概率不超过10万分之6.30。

3 结论

通过研究我们共获得了8个SNP候选标记，结合两种红鲤在我国的养殖情况和分布范围，使用5～7个SNP标记即可实现两种红鲤不同群体数量的鉴定。据中国渔业统计年鉴，2019年江西省鲤鱼总产量近15万t，只需使用7个SNP标记就能基本满足荷包红鲤和兴国红鲤的鉴定需求。普通小型实验室使用等位特异性PCR结合毛细管电泳的方法[23-24]，即可实现对兴国红鲤和荷包红鲤的快速鉴别。本研究为两种红鲤快速、准确鉴别提供了新思路、新方法，有利于提高选育工作的效率和可靠性。◇

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Identification of Purse Red Carp and Xingguo Red Carp Based on SNP Markers

WANG Yan-yun，WANG Ji-shi，LIU Xiao-xia，ZHAO Lu-yao，ZHAO Ru-ting，YANG Shu-ming

（Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Quality and Safety of Agricultural Products，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Beijing 100081，China）

Abstract：Xingguo red carp（C.carpio var.xingguonensis）and Purse red carp（C.carpio var.wuyuanensis）are precious red carp varieties.As excellent hybrid parents，they are widely used in variety improvement and breeding of new varieties.Due to the small morphological difference，the confusion of two varieties of red carp is common to occur in the selection of hybrid parents.By reading a large number of references and using database site selection and trait loci selection，we obtained 8 candidate SNP markers.Using 7 SNP markers，the identification error rate of two red carp in China was 6.30E-05，which is of great significance to the conservation and breeding of the germplasm resources of the two breeds.

Keywords：Xingguo red carp;Purse red carp;SNP marker;identification