APAP诱导小鼠急性肝损伤中免疫细胞的动态变化

包玉龙

(内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110)

APAP具有止痛和解热特性，是最常用的药物之一。推荐剂量下，安全有效，而过量可能导致急性药物性肝损伤(DILI)[1]。实际上，APAP引起的肝损伤是许多国家DILI的最主要原因，占美国所有肝损伤病例的近50%和英国的60%[2-3]。尽管通常可以通过停止服用APAP来改善，但在某些情况下，严重APAP所致肝损伤可以致命[4]。

人类肝脏包含多达1010个常驻淋巴细胞[5],由B细胞、T细胞、自然杀伤(NK)、自然杀伤T(NKT)细胞组成。NK/NKT细胞、巨噬细胞的病理作用已经使用APAP诱导肝损伤小鼠模型进行了深入研究[6]。淋巴细胞募集，炎症增加，炎症的性质和程度决定了损伤的进展和严重程度，同时，DILI与淋巴细胞浸润有关。然而，这些细胞在损伤发病机制中的确切作用仍存在争议[7]。目前，关于肝巨噬细胞的作用，已经证明这些细胞通过产生促炎细胞因子和介质，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β和一氧化氮，促进APAP诱导肝毒性。肝巨噬细胞还通过产生细胞因子和介质（如IL-10、IL-6和IL-18结合蛋白）发挥保肝作用，这些蛋白可以对抗炎症事件并促进肝脏再生[8]。与巨噬细胞一样，中性粒细胞也会在组织损伤后清除细胞碎片。调节性T细胞对控制自身反应性T细胞和缓解炎症具有重要的意义。它们能够维持稳定的慢性炎症并防止爆发性组织破坏。肝内调节性T细胞的频率和功能影响慢性病毒性肝炎和肝损伤的结果，肝脏中调节性T细胞和效应T细胞的募集和存活之间的平衡可能决定DILI的结果[9-11]。然而，以往的研究多数都局限在肝脏损伤过程中的某一个时相中，目前对于APAP诱导急性肝损伤过程中的各类免疫细胞的动态变化尚未见报道。因此研究对APAP诱导急性肝损伤过程中代谢时相、损伤时相和修复再生时相中固有免疫细胞和适应性免疫细胞的动态变化情况具有重要的临床指导意义，为进一步揭示APAP急性肝损伤的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料。选择6周龄的雄性C57BL/6野生型小鼠作为实验动物，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 试剂。APAP（Sigma,美国），ALT、AST ELISA试剂盒（南京建城生物有限公司）,TNF-α和IL-1 ELISAELISA试剂盒(江苏酶标生物科技有限公司),FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、FITC-CD3、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25流式抗体（Abcam,美国）,DAB试剂盒、HE染色试剂(福州迈新生物技术开发有限公司)。

1.1.3 仪器。智能型高效离心机(Beckman Coulter,美国),超纯水制造系统(四川优普超纯科技有限公司),流式细胞仪(Beckman Coulter,美国),酶标仪（Bioteck,美国）,倒置显微镜(Nikon,日本),切片机、包埋机、摊烤片机(Leica,德国)。

1.1.4 培养基。RPMI-1640培养基(Sigma,美国)。

1.2 方法

1.2.1 急性肝损伤模型的构建。将雄性C57BL/6野生型小鼠在可控的室温下饲养，温度25±2℃，相对湿度55%±10%，进行12 h的明暗循环。将70只小鼠随机分为2大组：对照组，模型组。模型组分为损伤后1、2、3、5、7、14、21 d为时间点，每个时间点有对照组5只，模型组5只。向模型组腹膜内注射APAP溶液（200 mg/kg），引起急性肝损伤。建模后的每个时间点，在小鼠中进行异氟烷麻醉，从眼球收集血液并解剖肝脏。在解剖前，确保小鼠停止进食12 h时并自由饮食。

1.2.2 ELISA法检测生物化学指标。将血样在4℃下凝结，并在3000 g离心15 min后从血样中分离血清样品，-20℃保存，用于ELISA检测。

使用南京建城生物有限公司ELISA试剂盒，检测血清中ALT和AST的水平，以反映ALT和AST的活性。

使用南京建城生物有限公司ELISA试剂盒检测ALT、AST；使用江苏酶标生物科技有限公司ELISA试剂盒检测TNF-α和IL-1，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。在测定样品前需绘制标准曲线，将标准品稀释成1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL浓度，各取100μL待测血清加到96孔板内，每孔重复3次，在室温下孵育3 h。使用酶标仪在450 nm测定光密度，根据标准曲线计算血清ALT、AST、TNF-α和IL-1的含量。

1.2.3 HE染色。将切除的肝组织切成适当的大小，4%多聚甲醛固定，固定后石蜡包埋，将包埋后的组织切成4μm厚度，脱水，苏木素-伊红（HE）染色，用中性树胶封片，显微镜下观察组织。

1.2.4 流式检测免疫细胞。取小鼠的相同肝叶，将其放入含1640培养基的培养皿中。用注射器塞子在200目过滤器上挤压肝脏以获得细胞悬液。将获得的细胞悬液连续过滤到带有200目的过滤器的15 ml离心管中，并以1000 r/min离心8 min。密封后，分别加入FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25抗体，在4℃下在黑暗中孵育30 min，离心收集细胞，重悬于PBS中,并上机检测。

1.2.4 统计学分析。试验数据以5只实验动物的平均值±SD表示,采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。通过单因素方差分析进行分析，并进行Tukey检验，以检验各种处理之间的显着差异,P＜0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 小鼠血清ALT、AST表达水平变化

ELISA法检测血清中ALT、AST表达水平，从图1可以看出，与对照组Con相比，高剂量APAP处理小鼠第1d时，小鼠血清中ALT、AST水平升高并已达到峰值（ALT为372.71±1.58 U/L；AST为143.78±13.81 U/L），从APAP处理第2d，ALT、AST表达水平明显下降（ALT为106.03±21.42 U/L；AST为20.10±2.27 U/L），在APAP诱导小鼠肝损伤后第3~14日ALT、AST水平与对照组无差异（对照组：ALT为8.37±1.78 U/L，AST为13.18±3.67 U/L；第14d ALT为9.84±3.15 U/L，AST为9.61±0.97 U/L）（见图1）。表明APAP诱导的肝损伤模型成功。

图1 ALT、AST表达变化情况

2.2 APAP诱导急性肝损伤过程中组织病理学变化

利用光学显微镜观察肝组织病理改变，病理检测图片如图2所示。从图中可以看出，APAP处理2 d肝门静脉区1/3以上面积的肝细胞凝固型坏死。APAP处理5 d，损伤修复区肝静脉至肝血窦轴系上可见大量炎性细胞浸润，炎症可造成肝损伤修复后炎症的持续性损伤。APAP处理7 d炎症消退，肝组织结构恢复正常，只是在少量静脉区还存在一定的炎细胞浸润（见图2）。上述结果表明，APAP诱导的肝损伤第7日已基本完成肝损伤修复。

图2 APAP诱导急性肝损伤中组织病理学变化

2.3 APAP诱导急性肝损伤过程中炎症因子表达变化

ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α的含量，从图3可以看出，IL-1β对照组含量为37.21±0.25，TNF-α对照组为234.2±12.02。高剂量APAP处理小鼠第2 d时，小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平显著升高，IL-1β升高至82.44±6.40，TNF-α为345.51±39.79（P＜0.05），在之后5d、7d、14d仍维持较高的水平（P＜0.05）（见图3A、B）。表明IL-1β、TNF-α在肝损伤及肝损伤修复中起着主要的作用。

图3 APAP诱导急性肝损伤中炎症因子表达变化

2.4 APAP诱导急性肝损伤过程中固有免疫细胞动态变化

流式细胞术法测定肝脏组织中的NK细胞、巨噬细胞和树突细胞含量，从图4可以看出，与对照组相比（NK细胞数量254±22.11，巨噬细胞数量356.33±31.89），高剂量APAP处理小鼠第3日时，NK细胞、巨噬细胞水平显著升高（NK细胞数量1353±50.76，巨噬细胞数量4640±122.87）（P＜0.05），从APAP处理第5日，NK细胞、巨噬细胞明显下降（NK细胞数量547±172.81，巨噬细胞数量1063.33±221.22），并与对照组无明显差异。而树突细胞在APAP处理小鼠第2日显著升高，对照组树突细胞数量为3049.66±200.4，第2日为4532.43±187.54；从第3日开始明显下降，第5日时（1577±312.78）与对照组比较差异显著（P＜0.05）。表明NK细胞、巨噬细胞和树突细胞的数量在肝损伤及肝损伤修复过程中发生显著的变化。

图4 APAP诱导急性肝损伤过程中固有免疫细胞动态变化

2.5 APAP诱导急性肝损伤过程中适应性免疫细胞动态变化

流式细胞术法测定肝脏组织中成熟T淋巴细胞含量，从图5可以看出，与对照组相比，高剂量APAP处理小鼠第5日时，CD3+成熟T细胞、辅助性CD3+CD4+T细胞和CD4+CD25+调节性T细胞数量显著升高（P＜0.05），第7日仍处于较高状态，与对照组有显著差异（P＜0.05），第14日已降低，与对照组无差异。而对于抑制性CD3+CD8+T细胞而言，高剂量APAP处理小鼠第3 d时，细胞数量显著升高（132.5±16.74）（P＜0.05），第5日和第7日仍处于较高状态，与对照组（33±7.21）有显著差异（P＜0.05），第14日已降低（56.67±4.18），与C无差异。表明，抑制性CD3+CD8+T和CD3+成熟T细胞、辅助性CD3+CD4+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞在肝脏修复不同时相产生动态变化。

图5 APAP诱导急性肝损伤过程中适应性免疫细胞动态变

3 讨论

肝脏是人体药物代谢的场所，容易受到药物代谢损伤，近年来药物导致的肝损伤备受关注。APAP是临床广泛运用的阵痛解热药物，APAP过量是急性肝功能衰竭的最常见原因之一[12]。APAP所致肝损伤的时相分为三个阶段，代谢时相，损伤时相和修复再生时相[13]。本文主要探讨三个时相中，先天免疫细胞，包括巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、炎症因子发挥的作用。

APAP肝损伤模型是一种显著临床相关性的药物肝损伤模型[14]，在APAP肝损伤模型中，AST和ALT绝大部分分布在肝细胞内，当肝脏受损时，肝细胞膜破坏，AST和ALT进入血液，血液中AST和ALT水平升高[15]。本研究APAP处理后24 h，血清中ALT、AST水平升高并达到峰值，APAP组小鼠肝脏损伤明显，表面有点状充血、变性和坏死，说明造模成功。

从本实验HE图看出，肝脏第2日，第5日肝脏损伤，处于损伤时相，期间TNF-α、IL-1β升高，NK细胞、巨噬细胞、树突细胞第2日升高，第3日开始降低，CD3+成熟T细胞、辅助性CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞从第5日升高。HE图中肝脏第7日肝脏状态与对照相当，处于修复再生时相，期间TNF-α、IL-1β仍处于较高状态，NK细胞、巨噬细胞、树突细胞降低；CD3+成熟T细胞、辅助性CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD4+CD25+调节性T细胞仍处于较高状态。IL-1β是巨噬细胞的产物，有研究发现[16-19]，APAP诱导的急性肝损伤模型中，IL-1β主要依赖NK细胞产生的TNF-α所诱导，从而导致严重的急性肝损伤。同时，肝脏巨噬细胞的作用一直在争议之中。在本研究中，我们发现APAP处理后巨噬细胞，NK细胞在第3日显著增加，随后下降，树突细胞在处理后的第2日明显升高。也有研究表明[20]，树突状细胞耗竭也加剧了对乙酰氨基酚的肝毒性。从本实验中也能够看出，树突细胞在损伤后第2日后开始急剧下降，肝脏损失严重。

研究还发现NK细胞可以通过杀伤非成熟的DC和分泌促炎症因子，促进T细胞的活化并能招募免疫细胞到达感染部位[21-22]。本实验中发现，成熟T细胞总数在5日开始急剧的增加，在第7日达到最高峰后，在14日时又恢复到对照组的水平。研究发现调节性T细胞对控制自身反应性T细胞和缓解炎症很重要，它们维持稳定的慢性炎症并防止爆发性组织破坏[17]。由此可以看出，在APAP急性肝损伤过程中，在损伤早期固有免疫细胞在炎性损伤中发挥重要作用，而在损伤修复期由成熟T细胞发挥主要作用。但其具体机制有待进一步研究。

4 结论

高剂量APAP处理小鼠后，血清中ALT、AST水平升高，肝细胞损伤。在APAP肝脏损伤不同时相中，固有免疫、适应性免疫发挥着不同的作用。坏死的肝细胞产生细胞因子IL-1β、TNF，在肝损伤修复期仍处于较高状态；同时固有免疫细胞巨噬细胞、NK细胞、树突细胞在损伤时相升高，修复再生时相降低至正常水平；T细胞发生动态变化，在损伤时相和修复再生时相处于升高状态，14日后降低至正常状态。本研究证实了肝损伤过程中，免疫因子、固有免疫细胞、适应性免疫细胞在肝损伤修复中的动态变化，并长时间观察了APAP肝损伤的修复过程，但具体的关联性仍需要进一步探索。