柱花草磷高效种质筛选及根系形态对低磷胁迫的响应分析

刘允熙，罗佳佳，雷 健，刘国道*，刘攀道*

(1.海南大学热带作物学院，海南 海口, 570228；2.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 海口, 571101)

磷(phosphorus，P)是植物生长所必需的大量营养元素之一，不仅是生物大分子(如DNA,RNA、磷脂质、ATP等)的重要结构成分，而且参与植物多种细胞进程(如光合作用、能量转移和碳代谢的细胞信号传导和调控等)[1-2]。土壤中能被植物直接吸收利用的无机可溶性磷酸盐(orthophosphate，Pi)仅占全磷含量的1%左右[3]，磷有效性较低，这严重限制了作物和牧草的生长和产量[4-6]。在农业生产上，农民大量施用磷肥以应对低磷胁迫，但作物对磷肥的利用效率较低，只有约15%～20%的磷肥可被作物吸收利用，且过量的磷肥通过地下水和地表水径流淋失，严重污染环境[7]。

植物磷效率(P efficiency)可分为磷吸收效率(P uptake efficiency)和磷利用效率(P utilization efficiency)[8]。为应对低磷胁迫，植物形成了一系列机制来促进磷的吸收和利用，如：改变根系形态构型、增加根毛的数量和长度、根系分泌有机酸和酸性磷酸酶、体内含磷代谢物的再活化利用等[9]。在这些适应性机制中，植物的根系形态对土壤磷的吸收至关重要。已有的研究表明，磷效率的基因型差异在农作物(如水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、小麦(Triticumaestivum)和玉米(Zeamays)等)中普遍存在[10-12]。通过对不同作物的种质资源材料开展磷效率评价，筛选出磷高效基因型，对于作物磷效率的遗传改良具有重要意义。

植物扩展蛋白(Expansins,EXP)属于多基因超家族，可被分为4个亚家族，即α-expansins(EXPA)、β-expansins(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)[13]。EXP的主要生物学功能是调节植物细胞壁松弛和伸展，进而影响根系的生长发育，前期研究报道EXP在植物适应多种非生物逆境胁迫(如盐害、干旱、低氮、低磷等)过程中发挥着重要作用[14-15]。目前，被报道参与植物适应低磷胁迫的EXP主要属于EXPB和EXLB亚家族成员，它们通过调控植物根系形态构型来促进磷的吸收，如：小麦的TaEXPB23、大豆的GmEXPB2和GmEXLB1[15-16]。

柱花草(Stylosanthesguianensis)是一种优良的热带的豆科牧草与绿肥作物，其对酸性缺磷土壤的适应性强[17-18]。但是，柱花草根系形态在适应低磷胁迫过程中发挥的作用仍不清楚。本研究通过对31份柱花草种质开展磷效率评价和根系性状分析，筛选到磷高效基因型TF291和磷低效基因型TF343；随后检测了这两个基因型根系中6个扩展蛋白编码基因SgEXPs响应低磷的表达模式。研究结果将为选育磷高效柱花草品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料和培养条件

本研究所用31份不同基因型圭亚那柱花草种子材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所“国家热带牧草中期备份库”(热带牧草库)提供(表1)。本试验在海南大学热带作物学院科研基地的大棚中进行，采用1/2 Hoagland营养液进行水培。试验简要流程为：取适量柱花草种子，于80℃的热水中热激处理2 min，放于垫湿润滤纸的培养皿中催芽1～2 d，在含250 μmol·L-1KH2PO4的营养液中预培养7 d，选取长势良好、一致的幼苗，分别进行正常供磷(+P，添加250 μmol·L-1KH2PO4)和低磷胁迫(-P，添加5 μmol·L-1KH2PO4)处理，培养液pH为5.8～6.0，每隔3 d更换一次，每个处理设置6个生物学重复。处理培养15 d后，分别收取地上部和根部样品，检测其干重、全磷含量、根系参数，分析SgEXPs基因响应低磷胁迫的表达模式。

表1 31份供试圭亚那柱花草材料信息

1.2 方法

1.2.1干重、全磷含量和根系指标测定 生物量测定：样品收获后，在105℃杀青30 min，70℃恒温烘干后称其干重。

全磷含量测定：收取的柱花草样品烘干粉碎后，称取0.02 g于100 mL消煮管中，加浓硫酸2 mL，于马弗炉中消解至无色，冷却后，双蒸水定容至100 mL，待测。参照Murphy和Riley[19]的方法，采用钼锑抗比色法，测定OD700的吸光度值，计算全磷浓度。

根系指标测定：将柱花草根系展开，使其呈不重叠状态，使用EPSON Expression 12000XL根系扫描仪扫描获取根系图像，再利用WinRHIZO(2009)软件统计总根长、根表面积、根体积。

1.2.2柱花草扩展蛋白理化性质和进化树分析 参考Luo等[20]研究从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取柱花草6个扩展蛋白的CDS序列，同时从Phytozome数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)获取6个拟南芥扩展蛋白和大豆的GmEXLB1序列，大豆的GmEXPB2序列来自于NCBI数据库。蛋白分子量与等电点预测采用Editseq软件。多序列比对与蛋白进化树构建分别采用Cluster X和MEGA(v5.50)软件。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 参照TRIzol(Invitrogen Inc，美国)方法提取柱花草总RNA，并用Vazyme公司的HiScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)逆转录出cDNA。使用Rotor-Gene Q(Qiagen,Hilden，德国)仪器和SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中国)定量试剂盒进行反应。反应体系为20 μL，包括10 μL 2×SYBR qPCR Master mix，1.6 μL引物(10 μmol(L-1)，2 μL cDNA模板，6.4 μL ddH2O。反应条件为95℃ 30 s，94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。参考Luo等[20]方法，定量引物见表2。基因相对表达量=目的基因表达量/内参基因(SgEF-1α)表达量。

表2 本研究所用引物列表

1.3 数据统计分析

本研究相关数据采用Microsoft Excel 2013(Microsoft Company，美国)进行整理和可视化作图，数据结果以平均值和标准误(SE)表示，利用SPSS 20.0软件(IBM-SPSS，美国)对同一基因型柱花草不同磷源处理(+P和-P)下的指标进行独立样本T检验，分析其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫对柱花草干重和全磷含量的影响

如图1A所示，与+P处理相比，-P处理显著抑制了柱花草的干重(P<0.05)，干重降低了20.77%(TPRC2001-1)～70.04%(TF399)。同样，-P处理下的植株全磷含量比+P处理降低53.275%(TF246)～93.08%(TF394)，差异显著(P<0.05)(图1B)。

图1 低磷胁迫对31个基因型柱花草干重(A)和全磷含量(B)的影响

2.2 柱花草的磷效率分类

依据植物对养分效率和施肥反应程度的不同，参考Gerloff的分类标准[21]，将不同磷效率的植物的分为4种类型(即Ⅰ～IV)，其中I类为磷高效高响应型，即植物的产量、生物量或者磷积累量等在低磷和高磷处理下均高于平均值；II类为磷低效高响应型，即植物的产量、生物量或者磷积累量等在低磷处理下低于平均值，在高磷处理下高于平均值；III类为磷低效低响应型，即植物的产量、生物量或者磷积累量等在低磷和高磷处理下均低于平均值；IV类为磷高效低响应型，即植物的产量、生物量或者磷积累量等在低磷处理下高于平均值，在高磷处理下低于平均值。

依据31个基因型柱花草的干重和全磷含量，将柱花草分为4类(图2)。首先，以干重指标进行分类，其中磷高效高响应型(Ⅰ)包括7个：TF226，TF234，TF246，TF291，TF244，TF181和TF348；磷低效高响应型(Ⅱ)包括10个：TF399，F354，TF394，TF403，TF404，TF344，TF331，TF250，TF245和TF347；磷低效低响应型(Ⅲ)包括10个：TF335，TF341，TF243，TF239，TF206，TF242，TF343，TF213，TF240和TF175；磷高效低响应型(Ⅳ)包括4个：TF223，TF231，TF238和TPRC2001-1(图2A)。

其次，以全磷含量指标进行分类，其中磷高效高响应型(Ⅰ)包括9个：TF291，TF231，TF226，TF341，TF234，TF348，TF331，TF335和TPRC2001-1；磷低效高响应型(Ⅱ)包括4个：TF354，TF394，TF344和TF399；磷低效低响应型(Ⅲ)13个：TF347，TF403，TF404，TF245，TF181，TF250，TF239，TF240，TF343，TF206，TF242，TF175和TF213；磷高效低响应型(Ⅳ)包括5个：TF243，TF238，TF244，TF246和TF223(图2B)。

最后，在干重和全磷含量指标分类一致的基因型中，磷高效高响应型(Ⅰ)包括4个：TF226，TF234，TF291和TF348；磷低效高响应型(Ⅱ)包括4个：TF354，TF394，TF344和TF399；磷低效低响应型(Ⅲ)包括7个：TF175，TF213，TF343，TF239，TF240，TF206和TF242；磷高效低响应型(Ⅳ)包括3个：TF223，TF238和TF244(图2)。

图2 以生物量(A)和全磷含量(B)为指标对31个基因型柱花草的磷效率和磷响应分类

2.3 低磷胁迫对柱花草根系形态的影响

为评估低磷胁迫对柱花草根系形态的影响，本研究分析了低磷胁迫下31个基因型柱花草总根长、根表面积和根体积的变化，发现柱花草根系形态响应低磷胁迫具有基因型差异(图3)。其中，与正常供磷相比，低磷处理下，2个基因型(TF291和TF239)柱花草的总根长、根表面积和根体积均显著增加(P<0.05)；2个基因型(TF246和TPRC2001-1)柱花草的总根长和根体积均显著升高(P<0.05)，但其根表面积无显著差异；7个基因型柱花草(TF250,TF343,TF344,TF354,TF394,TF399,TF403)的总根长、根体积和根表面积均显著降低(P<0.05)(图3)。

图3 低磷胁迫对31个基因型柱花草总根长(A)、根表面积(B)和根体积(C)的影响

综上所述，同时以干重和全磷含量为指标进行的磷效率分类，结合根系参数对低磷胁迫的响应，发现TF291柱花草为磷高效高响应型，同时低磷处理显著增加其总根长、根表面积和根体积(P<0.05)(图2，3)。相反，TF343柱花草为磷低效低响应型，低磷处理下其总根长、根表面积和根体积均显著降低(P<0.05)(图2，3)。

2.4 柱花草扩展蛋白理化性质和进化树分析

柱花草6个扩展蛋白SgEXPB1，SgEXPB2，SgEXPB3，SgEXLB1，SgEXLB2，SgEXLB3预测的蛋白分子量分别为29.37 kDa，29.38 kDa，28.56 kDa，28.31 kDa和28.18 kDa，28.32 kDa；蛋白等电点分别为4.76，8.70，8.02，7.46，5.51和8.74。随后的进化树分析表明，柱花草的6个扩展蛋白基因分为两个亚家族，其中SgEXPB1，SgEXPB2和SgEXPB3属于EXPB亚家族，而SgEXLB1，SgEXLB2和SgEXLB3属EXLB亚家族(图4)。柱花草的SgEXPB1与大豆的GmEXPB2同源，SgEXPB2和SgEXPB3与拟南芥的AtEXPB1和AtEXPB3同源性较高。此外，柱花草EXLB亚家族的3个成员SgEXLB1，SgEXLB2和SgEXLB3均与大豆的GmEXLB1同源性较高，而SgEXLB2的同源性最高(图4)。

图4 柱花草扩展蛋白的系统进化树分析

2.5 扩展蛋白基因在不同柱花草根系中响应低磷胁迫的表达模式分析

本研究以磷高效高响应型(TF291)和磷低效低响应型(TF343)柱花草为材料，利用qRT-PCR技术，分析了柱花草6个扩展蛋白响应低磷胁迫的表达模式。如图5所示，-P处理使SgEXPB2基因在TF291和TF343基因型柱花草的根系中相对表达分别显著增加3.73倍和1.52倍(P<0.05)(图5B)。对于SgEXLB1基因，在-P处理的TF291柱花草根系中，相对表达量比+P处理显著增加1.61倍(P<0.05)，但在TF343柱花草根系中性对表达量无显著差异(图5D)。以上结果表明，在磷缺乏条件下，磷高效高响应型柱花草(TF291)根系会诱导SgEXPB2上调表达，且上调水平比磷低效低响应型柱花草(TF343)更高，同时TF291柱花草还增加SgEXLB1基因的表达以响应低磷胁迫。

图5 不同磷水平下柱花草扩展蛋白基因相对表达量分析

3 讨论

磷在植物生长发育过程中起着重要的作用，低磷胁迫显著抑制植物的生长[22]。例如，低磷胁迫下辣椒、水稻等植物的地上部和整株干重均显著降低[23-24]。类似的，本研究发现，低磷胁迫下不同基因型的柱花草的生物量和全磷含量均不同程度的降低(图1)。研究表明，在大豆、油菜(Brassicanapus)等作物中植物的磷效率存在显著的基因型差异，与磷低效基因型材料相比，磷高效基因型材料的生物量和全磷含量均较高[25-26]。此外，Du等发现12个基因型柱花草的磷效率存在显著的基因型差异，其中磷高效基因型柱花草TPRC2001-1的地上部生物量和全磷含量明显较高[27]。同样，本研究结果也表明31个基因型柱花草的磷效率也存在显著差异(图1)，并筛选到4份磷高效高响应型柱花草：TF226，TF234，TF291和TF348(图2)。

研究表明，植物可通过改变根系形态和根系构型来适应低磷胁迫，例如增大根冠比、促进侧根伸长、增加根毛密度等，扩大根系分布范围[28]。本研究发现，磷高效高响应型柱花草TF291的总根长、根表面积和根体积均显著升高(图2，3)，而磷低效低响应型柱花草TF343的总根长、根表面积和根体积均显著降低(图2，3)，故柱花草适应低磷的能力可能与根系的发达程度相关。

扩展蛋白基因可调控细胞壁的松弛和伸展，使根系构型发生改变[15]。已有研究表明，EXPB和EXLB亚家族的基因成员(例如小麦的TaEXPB23[29]和大豆的GmEXLB1)在低磷胁迫下参与调控植物的根系结构和形态[16]。本研究中，低磷胁迫显著上调SgEXPB2基因在磷高效高响应型柱花草TF291和磷低效低响应型柱花草TF343根系中的相对表达量，但在TF291中的上调倍数更高(图5B)。同时，与正常供磷相比，TF291柱花草低磷根系中SgEXLB1也显著上调，但SgEXLB1在TF343柱花草中无显著变化(图5D)。因此，柱花草可能通过上调表达SgEXPB2和SgEXLB1扩展蛋白基因，以调控根系的生长，进而适应低磷胁迫。

4 结论

综上所述，柱花草的磷效率存在显著的基因型差异，磷高效基因型TF291在低磷胁迫下通过提高SgEXPs表达来促进根系生长，以适应低磷胁迫。