长毛拟青霉发生对羊肚菌根际土壤真菌群落结构的影响

谭一罗，苏文英，任立凯，樊继伟，周振玲，杨和川

(连云港市农业科学院，江苏连云港 222000)

羊肚菌别名美味羊肚菌、羊肚子、蜂窝蘑等，是羊肚菌属(Morchella)真菌的总称，具有抗肿瘤、保护心血管、增强免疫等药理学作用。羊肚菌在全球都广泛分布，但是在人工栽培和生产中面临着复杂的病虫害，严重影响羊肚菌的产量和品质。土壤微生物对羊肚菌子囊果发育及病害发生的机理和影响至今仍不明确，因此，研究羊肚菌根际土壤微生物群落组成对其病害的发生机理及防控具有重要意义。由于田间环境复杂，羊肚菌菌塘极易发生真菌性病害，常见有镰刀菌属(Fusarium)引起的烂柄病、Diploosporalongispora引起的霉菌性枯萎病，竞争性杂菌如盘菌属(Peziza)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、鬼伞属(Coprinus)等，严重影响羊肚菌品质，给羊肚菌栽培者造成经济损失[1-2]。研究表明，根际微生物能够帮助植物吸收或利用土壤中的营养物质从而促进植物生长发育或抵抗病害，此外土壤微生物结构和功能也是土传病害的重要因素[3-4]。沈洪[5]采用变性梯度凝胶电泳技术研究了云南羊肚菌菌塘土壤的细菌和真菌群落组成，发现菌塘中盘菌纲(Pezizomycetes)的真菌种类较多，且群落差异较大。张相锋等[6]采用Biolog-ECO法分析了伊犁不同土层深度的野生羊肚菌根际微生物多样性，结果表明上层土壤具有更高的多样性。土壤微生物群落结构对羊肚菌病害发生具有重要影响，课题组分别从发生病害的羊肚菌菌柄和菌盖上分离出1株病原菌，经鉴定均为长毛拟青霉(Paecilomycespenicillatus)，本研究通过对健康羊肚菌和发生长毛拟青霉病害的羊肚菌根际土壤进行高通量测序，分析栽培羊肚菌后以及羊肚菌感染病害后的真菌群落结构，探究长毛拟青霉病害发生对土壤真菌群落的影响，为长毛拟青霉和其他土传病害的发生、防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

试验以羊肚菌子实体根际土壤为研究对象，于2020年3月17日随机采集江苏省连云港市海州区长势良好、健康的梯棱羊肚菌子实体9株，按Cui等[7]方法采集羊肚菌子实体根际土壤，每3株羊肚菌子实体根际土壤均匀混合作为1个样品，分别编号为Soil1.1、Soil1.2和Soil1.3。同日，按同样方法采集同一大棚内感染长毛拟青霉的羊肚菌子实体根际土壤，对应样品编号为Soil2.1、Soil2.2和Soil2.3。采集同一大棚内未栽培羊肚菌地块的土壤作为对照组，编号CK 0.1、CK0.2和CK0.3。采集的土壤样品装入 10 mL无菌离心管，液氮冷冻后于-80 ℃保存，备用。

1.2 DNA提取

1.3 真菌ITS 1区PCR扩增

利用真菌ITS 1区进行PCR扩增，上游引物F序列为5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，下游引物R序列为 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。扩增体系(30 μL)：2×Phanta Master Mix 15 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，模板DNA 2 μL(20 ng)，ddH2O 11 μL。扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，29个循环，72 ℃延伸5 min。

1.4 文库构建及Illumina MiSeq测序

1.5 数据处理

使用软件QIIME1.17对序列质量进行质控过滤，软件UPARSE7.1对OTU按97%相似水平进行聚类，并用UCHIME去除嵌合体序列。OTU分布维恩图通过VennDiagram绘制，利用软件Mothur v.1.21.1[8]对各土壤样品进行Alpha多样性分析，用R语言工具进行各样品的主成分分析，并绘制物种组成柱状图和聚类热图。

2 结果与分析

2.1 测序结果及OTU分析

Illumina高通量测序结果见表1。将测序中的嵌合体序列和单例序列剔除，Soil1组中样本平均有效序列数为118 181±5 737，Soil2组中样本平均有效序列数为122 023±11 357，CK组中样本平均有效序列数为12 3475±9 170。对每个样品随机抽取111 079条序列进行抽平，在0.97相似水平下进行聚类，得到每组样本OTU个数(图1)，Soil1、Soil2、CK组各自独有的OTU数分别为39、66、44，3组共有OTU数为175个。

表1 测序数据和OTU统计Table 1 Sequencing data and OTU statistics

2.2 多样性分析

土壤样品的Alpha多样性结果见表2。3组土壤样本覆盖率均达到99.9%以上，说明测序深度较高，基本能覆盖样品中所有物种，测序结果可以用于进一步分析。Alpha多样性结果表明，Soil2的Chao1指数、物种数、Shannon指数、Simpson指数均显著高于Soil1和CK；Soil1和CK的Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数没有显著差异，但是CK的物种数显著高于Soil1。说明土壤在栽培羊肚菌后真菌多样性降低，当羊肚菌发生长毛拟青霉病害后土壤真菌多样性明显增加。

表2 土壤样本Alpha多样性统计Table 2 Alpha diversity statistics of soil samples

2.3 群落结构分析

3组土壤样品在不同分类水平上的真菌群落结构如图2。图2-A表明子囊菌门(Ascomycota)是土壤样本的主要类群，其次是担子菌门(Basidiomycota)；栽培羊肚菌后，土壤担子菌门比例降低、子囊菌门比例上升，当发生长毛拟青霉病害后，土壤子囊菌门比例明显下降。图2-B表明伞菌纲(Agaricomycetes)和粪壳菌纲(Sordariomycetes)是3组土壤样品的主要类群，其次还有散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)等。羊肚菌生长使土壤中伞菌纲比例上升，粪壳菌纲、散囊菌纲、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、盘菌纲比例下降；发生长毛拟青霉病害后，伞菌纲比例下降，散囊菌纲、座囊菌纲、粪壳菌纲比例上升。

2.4 真菌群落结构聚类分析

样品物种丰度聚类热图(图3)可以看出，CK组中丰度较高的属有亡革菌属(Thanatephorus)、曲霉属(Aspergillus)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛壳菌属(Chaetomium)、Paramyrothecium、杯梗孢属(Cyphellophora)和棒孢属(Corynespora)；Soil1组中丰度较高的属有亡革菌属、曲霉属、稻瘟菌属、毛壳菌属和帚枝霉属(Sarocladium)；Soil2组中丰度较高的属有曲霉属、毛壳菌属、帚枝霉属、拟青霉属(Paecilomyces)、枝鼻菌属(Cladorrhinum)、锥盖伞属(Conocybe)、棒孢属、念珠菌属(Candida)和枝顶孢霉属(Acremonium)。结果表明羊肚菌菌丝生长对土壤真菌优势群落存在一定影响，长毛拟青霉病害发生后其根际优势真菌变化较大，长毛拟青霉丰度升高，同时还富集了更多的真菌群落。

2.5 真菌群落结构的主成分分析

对土壤样品OTU组成进行主成分分析，以第1、第2主坐标的排序绘制二维聚类图(图4)。可以看出，聚类图将土壤样本聚为3类，同组样本OTU组成相似，在聚类图中分布较近。说明Soil1、Soil2和CK土壤样本真菌组成存在差异，羊肚菌生长及长毛拟青霉病害均能改变土壤原有真菌群落结构。

3 讨 论

近年来，Illumina Miseq测序技术广泛应用于土壤、肠道等微生物群落结构研究，与传统方法相比具有高通量、自动化、低成本、快捷等优势[9]。在OTU统计过程中，真菌38%的singletons可能是潜在的假物种，大部分的singletons都能划分到低水平的分类单元中，即稀有物种，所以去除singletons可能会低估样品多样性[10]。本研究考虑到稀有物种在整个群落中的作用较弱，因此去掉所有singletons后进行土壤群落结构的分析。

陈诚等研究表明镰刀菌感染导致的羊肚菌烂柄病发生会导致拟青霉属真菌的富集，其发病子实体根际中曲霉属、拟青霉属、木霉属等真菌丰度较高[11]，该结果与本研究基本一致，本研究在感染长毛拟青霉羊肚菌的根际也检测到了镰刀菌属，推测这些病原真菌共同作用导致菌塘病害发生。张婷等研究表明羊肚菌土壤真菌优势类群为盘菌纲、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycota)、粪壳菌纲、座囊菌纲和散囊菌纲，与本研究中的优势类群大多数一致[12]。沈洪等[13]通过真菌28S rDNA基因信息比较了羊肚菌菌塘土壤的微生物多样性，研究共测得了12种真菌，其中盘菌纲10种，异担子菌纲1种，未知1种，且仅羊肚菌菌塘土壤能检测出羊肚菌。本研究中羊肚菌根际土壤样品均可检测到羊肚菌属，未生长羊肚菌的对照土样检测不到羊肚菌属或丰度极低，推测可能是由于对照土样与试验组处于同一大棚内，因此个别样品检测到了极低丰度的羊肚菌。

由于羊肚菌菌丝和菌塘中其他真菌存在竞争关系，健康羊肚菌基脚土中羊肚菌菌丝占优势地位，各种杂菌占劣势地位，所以羊肚菌栽培后土壤真菌多样性降低，子囊菌门比例上升、担子菌门比例下降，粪壳菌纲、散囊菌纲等杂菌较对照土样比例下降；而长毛拟青霉病害发生后富集了更多的竞争性杂菌，羊肚菌菌丝生长受到抑制，加之气温回升导致菌塘中青曲、霉等杂菌大量发生，所以土壤真菌多样性增加，子囊菌门比例下降，散囊菌纲等杂菌比例上升。栽培羊肚菌土壤中伞菌纲比例较高推测是菌塘中常伴生鬼伞属等竞争性杂菌导致。本研究通过Illumina Miseq平台测序和分析，在3组试验土壤样品中均检测到了拟青霉属真菌，且发生病害组土壤样品的拟青霉属、枝顶孢霉属、棒孢属等真菌丰度升高，说明在病害发生过程中发生了富集。因此，在羊肚菌栽培前抑制拟青霉属、棒孢属、镰刀菌属等羊肚菌病原菌群，维持合理的土壤真菌结构，对羊肚菌生产具有重要意义。