PEG 6000模拟干旱胁迫下甘蓝型油菜芽期及苗期抗旱指标筛选

刘 翔，左凯峰，许 伟，郭 娜，秦梦凡，徐 宇，马 宁，李青青，张 淼，李浩东，王茸茸，黄 镇，徐爱遐

(1.西北农林科技大学农学院，陕西 杨凌 712100；2.勉县原种场，陕西 勉县 724200)

水资源短缺是一个全球性问题，干旱是制约农业发展最严重的非生物因素之一[1]，每年我国农业均因干旱造成重大损失[2]。油菜是我国第一大油料作物，在国民经济中占有重要的地位[3]。我国目前种植油菜中大部分为甘蓝型油菜，甘蓝型油菜整个生长期需水量较大，对干旱的适应性较差，干旱不仅制约着产量的提升，也制约着种植面积的扩大[4]。因此，在油菜生产中耐旱性研究是一项非常重要并且十分紧迫的任务。

干旱胁迫后植物会产生一系列的形态、生理变化，如根长、含水量、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性等。可通过植物受到干旱胁迫后的形态、生理指标变化来鉴定其对干旱的敏感程度[5]。许媛君[6]利用PEG 6000模拟干旱胁迫研究白菜型油菜芽期抗旱性，认为发芽率可作为白菜型油菜抗旱种质筛选的重要依据；胡承伟等[7]研究认为相对活力指数可作为油菜芽期抗旱性筛选的重要依据；王道杰等[8]通过对油菜苗期抗旱性研究，表明可溶性蛋白、SOD、CAT可作为抗旱性鉴定指标。

作物抗旱机制十分复杂，受到遗传因素、发育时期和环境的综合影响。因此，不同发育阶段的抗旱机制可能不同，导致作物不同发育阶段抗旱性强弱可能存在差别。不同年份和地区干旱发生的时期不同，明确作物种质不同生长期抗旱性强弱，能更好地发挥种质优势，以适应不同环境，对于农业生产具有重要意义。作物抗旱涉及到不同时期大量形态、生理生化指标的变化，给作物抗旱性鉴定带来了困难。筛选出能够准确评价抗旱性的指标对于研究作物抗旱性具有重要的意义。抗旱性综合度量值(D值)综合了各指标的相关关系及贡献，能够消除单一指标的局限性，得到较为准确的抗性评估，被广泛应用于作物的抗旱性评价[9-10]。

目前对于甘蓝型油菜的抗旱性研究大多只是芽期或苗期等单一时期，本研究对8份种质材料在芽期及苗期(五叶期)利用PEG 6000模拟干旱胁迫，分析其形态、生理指标变化，综合评价甘蓝型油菜芽期和苗期抗旱性，筛选芽期和苗期抗旱性评价指标，为油菜抗旱育种研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究供试材料为西北农林科技大学农学院油菜育种课题组前期培育鉴定的8份抗旱性不同的甘蓝型油菜骨干种质，编号分别为640，876，899，1057，1105，1876，2351和2417。

表1 供试材料Table 1 Test materials

1.2 试验方法

试验于2020年5—7月在西北农林科技大学油菜育种实验室的油菜培养间进行。

1.2.1 芽期鉴定 8个种质材料各取大小均匀、饱满、无病虫害的50粒种子灭菌后置于90 mm×15 mm的培养皿中，其中已放置灭菌后的一层滤纸和一层吸水纸作为芽床，分别加6 mL质量分数为5%、10%、15%、20%、25%的PEG 6000溶液进行处理，对照加等量蒸馏水，试验重复3次，置于25℃恒温光照培养箱中于16 h/8 h的光/暗条件培养7 d，记录发芽数及成苗数(将子叶展开成为正常幼苗记为成苗)，计算发芽率(GR)和成苗率(SR)。

1.2.2 苗期鉴定 上述8个材料种子正常发芽6 d后，各取长势一致的60株幼苗移栽至装有5 L 50% Hoagland营养液的水培盆中，隔4 d换一次营养液，待植株长至3叶期时更换为全营养液，置于25℃的恒温光照培养室中于16h/8 h的光/暗条件培养。幼苗培养至五叶期时，参考王卫芳[11]的方法，使用PEG 6000配置的渗透势为-0.14 MPa的营养液(2% PEG 6000)适应3 d后，改用PEG 6000配置的渗透势为-0.36 MPa的Hoagland营养液(4% PEG 6000)继续培养4 d，对照一直用Hoagland营养液培养，每个材料处理10株，对照10株，重复3次。处理后观察表型、取样，参考植物生理学实验指导[12-13]测定相关指标。利用称重法测量根冠比(RSR)和叶片相对含水量(RWC)；用叶绿素仪(型号：SPAD-502Plus；品牌：柯尼卡美能达； 产地：日本)测定SPAD值。丙二醛(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖(SSu)含量测定采用蒽酮法，可溶性蛋白(SPr)含量采用考马斯亮蓝G-250法测定，超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法，过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法。根冠比取整株测定，其余指标均取第三片叶测定，取2株叶片混样为一个重复，共3个重复。

1.2.3 数据处理与分析 利用Excel 2010对数据进行汇总整理，使用SPSS 25.0和GraphPad 8.4进行数据统计分析及作图。

1.2.4 抗旱性综合评价方法 计算抗旱系数、隶属函数值、抗旱性量度值D。主要公式如下[9]：

(1)抗旱系数Xj

Xj=各指标干旱处理测量值/对照测量值

(2)隶属函数值μ(Xj)

μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Xj代表各指标的抗旱系数，Xmin代表该指标抗旱系数最小值，Xmax代表该指标抗旱系数最大值。

(3)权重Wj

式中，Pj代表单个因子贡献率，Wj为该因子在所有公因子中的重要程度。

(4)抗旱性综合度量值D

式中，D值为不同甘蓝型油菜种质抗旱性综合度量值，n为指标个数。

2 结果与分析

2.1 芽期模拟干旱胁迫最适PEG浓度及鉴定指标

由图1可知，在不同浓度PEG 6000溶液处理下，8份材料对照组(CK)、5%、10%、15%处理组均有正常成苗，20%处理组均有发芽但无正常成苗，25%处理组既无发芽也无成苗。与CK相比，5%、10%、15% PEG处理下，1057发芽率有所升高，其余材料无明显变化，且8份材料各处理间发芽率无明显差异；20% PEG处理下，8份材料发芽率显著降低，且各材料间差异显著；25%处理组，8份材料均无发芽。8份材料的成苗率在5%处理下与CK相比无明显差异；在10% PEG处理下，1105和2351显著下降，其余材料无明显变化；15%处理组，成苗率显著降低，且8份材料间差异显著；20%和25% PEG处理下，8份材料无正常成苗。表明PEG处理下，发芽的临界浓度为20%，成苗的临界浓度为15%，成苗率相比于发芽率对PEG浓度的增加更敏感。不同浓度PEG处理下，8份材料发芽和成苗率的变化并不一致，说明干旱条件下，发芽的种子并不一定能成长为正常的幼苗，用发芽率来评价种质的抗旱性与实际生产中的抗旱性可能会有较大偏差，而PEG模拟干旱胁迫下的成苗率代表了种质在干旱条件下的成苗能力，与实际干旱条件下种质的生长表现更接近，对实际生产中抗旱品种的选育更有指导意义。15% PEG处理下，8份供试材料成苗率差异显著，因此，15%是鉴定甘蓝型油菜芽期抗旱性的最适PEG浓度，成苗率可作为甘蓝型油菜芽期抗旱种质鉴定的方便直观、相对准确的指标。根据15% PEG处理下8份材料的成苗率，将8份材料芽期抗旱性划分为3个等级：1057为芽期强抗旱型，640、1876、899、2417和876为芽期中等抗旱类型，1105和2351为芽期敏旱型材料。

2.2 甘蓝型油菜苗期抗旱性鉴定及抗旱指标筛选

2.2.1 苗期相关指标对干旱胁迫的响应 利用公式(1)计算出各个指标的抗旱系数(表2)，抗旱系数大小反映了各指标处理前后的差异，抗旱系数大于1，说明干旱处理后该指标相对于对照上升，数值越大上升越明显；反之，抗旱系数小于1，说明指标下降，数值越小下降越明显。据表2可知，各指标对于干旱胁迫的响应差异较大。与对照相比，SPAD值变化幅度较小，材料899抗旱系数最大，为1.36，1105最小，为0.8，供试材料平均抗旱系数为1.08。干旱胁迫下，除1876外，其余材料根冠比的抗旱系数均大于1，平均抗旱系数为1.48，说明干旱胁迫会促进根系生长获得更多水分从而提高根冠比。各供试材料叶片相对含水量相对于对照均明显下降，其中，640在干旱胁迫下的叶片保水能力最强，抗旱系数为0.85，2417保水能力最差，抗旱系数为0.67，说明不同材料在干旱胁迫下的水分调节能力不同。所有材料的可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛含量在干旱胁迫下均呈现不同程度升高，与对照相比，可溶性蛋白含量提升最大的是640，最小的是2417；可溶性糖含量最大的材料为1057，最小的是899；丙二醛含量最大的材料为899，最小的是640。与对照相比，大部分材料的抗氧化酶活性在干旱胁迫下明显上升，如640、1876等，而部分材料活性降低，如1057。上述结果表明，各指标对干旱胁迫的敏感程度不同，加之测量过程中可能出现的误差，很难通过单个指标客观、准确地反映种质的抗旱性，因此，必须通过多指标进行综合评价。

表2 甘蓝型油菜苗期各生理指标的抗旱系数Table 2 Drought resistance coefficients of physiological indexes at seedling stage of Brassica napus L.

2.2.2 苗期抗旱相关指标的主成分分析 为进一步明确甘蓝型油菜苗期各指标与抗旱性的关系，从而准确鉴定甘蓝型油菜苗期抗旱性，对苗期抗旱相关指标进行了主成分分析。由表3可知，3个主成分贡献率分别为56.2%、21.7%、14.8%，累计贡献率达到92.7%，覆盖了绝大部分的原始数据信息。决定主成分1大小的主要是相对含水量、可溶性蛋白和可溶性糖。说明主成分1代表的是水分调节因子，在植株受到干旱胁迫时有效调控，防止水分过量丧失；主成分2中载荷最高的是SOD和POD，代表了活性氧清除系统，降低植株在受到胁迫时因活性氧积累造成的伤害；主成分3中SPAD载荷量最高，POD次之。

表3 甘蓝型油菜苗期各生理性状的主成分分析Table 3 Principal component analysis of physiological characters at seedling stage of Brassica napus L.

2.2.3 苗期抗旱性综合评价 用公式(2)计算各指标隶属函数值，通过主成分分析及公式(3)计算出各抗旱指标权重，再用公式(4)计算抗旱综合度量值D，对8份材料进行排序，D值越大抗旱性越强，D值越小抗旱性越弱。由表4可知，8份材料中，D值范围在-0.161～0.993之间。按D值对8份材料进行抗旱性排序，8份材料苗期抗旱性强弱排序为640>1057>1876>2351>1105>876>899>2417。这与芽期抗旱性鉴定结果不完全一致，其中有些材料芽期和苗期的抗旱性基本一致，如1057、640和1876，而部分材料芽期和苗期抗旱性排名差异较大，如1105芽期抗旱性在8份材料中最差，苗期处于中等水平；2417芽期抗旱性表现为中等，而苗期表现最差。综上，甘蓝型油菜抗旱机制的复杂导致了其在不同生长时期的抗旱性发生了变化。因此，在不同时期抗旱性鉴定中方法和指标的选择十分重要。

表4 甘蓝型油菜苗期抗旱性综合评价排序Table 4 Ranking of comprehensive evaluation of drought resistance of Brassica napus L.

2.2.4 抗旱指标与抗旱性度量值的相关性分析 为进一步确定甘蓝型油菜苗期抗旱性鉴定指标，将苗期抗旱相关指标的抗旱系数与苗期抗旱综合度量值D值进行了相关性分析(表5)。结果表明，叶片相对含水量(0.907**)、可溶性蛋白含量(0.921**)与D值呈极显著正相关，丙二醛含量(-0.837**)与D值呈极显著负相关，其余指标与D值也有相关性，但不显著。说明相对含水量、可溶性蛋白和丙二醛含量可作为苗期抗旱性鉴定的有效指标。

表5 苗期抗旱指标与D值的相关性分析Table 5 Correlation analysis of drought resistance index and D value at seedling stage

3 讨论与结论

目前作物抗旱性鉴定主要采用土壤干旱法和高渗溶液模拟干旱法，后者由于操作简单、省时省力，并能够相对准确地控制胁迫程度而被广泛应用。其中PEG 6000由于其分子量大，不会进入植物细胞，除渗透胁迫外对植物造成的其他影响较小而被认为是干旱模拟的理想渗透调节物质[14]，从而广泛应用于油菜[15]、玉米[16]、小麦[17]、高粱[18]、大麦[19]等作物的抗旱性研究。选择适当浓度的PEG对于研究不同作物、不同发育时期的抗旱性是必要的。本研究采用不同质量分数PEG溶液对甘蓝型油菜芽期抗旱性进行分析，发现15%处理组供试材料抗旱性有明显差异，将15%作为甘蓝型油菜芽期抗旱性鉴定的最适PEG浓度。

发芽期是作物生长的关键期，播种后遭遇干旱会导致成苗减少，造成减产。很多研究[20-22]认为，发芽率可作为作物芽期抗旱性鉴定的指标，本研究通过比较PEG 6000模拟干旱胁迫下8份甘蓝型油菜发芽率及成苗率的变化，发现成苗率比发芽率对于干旱胁迫更敏感，与实际生产的联系更大，因此，成苗率比发芽率更适合作为芽期抗旱性的鉴定指标。植物受到干旱胁迫时，不仅会失水影响正常生长，还会加快活性氧的积累，严重时导致植株死亡[23]。渗透调节系统和活性氧清除系统是植物应对干旱胁迫的重要途径。缺水时植物体内会逐渐积累一些小分子的渗透调节物质，主要有脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱、游离氨基酸等，植物通过这些渗透调节物质保持细胞水分，维持细胞膨压[24]；同时，抗氧化酶(SOD、POD、CAT)能够有效清除植物体内积累的活性氧，减轻植物受到的损伤[25]，从而维持植物的生长。桂月晶等[26]研究表明，脯氨酸、可溶性蛋白含量和SOD、POD活性与抗旱性呈正相关；谢小玉等[27]对油菜苗期抗旱性进行研究，认为叶片相对含水量、丙二醛和叶面积可作为油菜苗期抗旱性鉴定的依据。本研究中叶片相对含水量、可溶性蛋白含量与抗旱性呈显著正相关，丙二醛含量与抗旱性呈显著负相关，这与前人研究基本一致。

本研究对8个甘蓝型油菜种质芽期及苗期的抗旱性进行了鉴定，结果表明，甘蓝型油菜芽期和苗期抗旱性不完全一致，甘蓝型油菜种质的抗旱性不能由某个发育阶段的抗旱性来决定。成苗率可作为芽期抗旱性鉴定指标，叶片相对含水量、可溶性蛋白含量及丙二醛含量与苗期抗旱性显著相关，这些指标在甘蓝型油菜抗旱性评价中可优先考虑。