牦牛GHR 基因exon 10 SNP对乳成分影响的研究

金鑫燕

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)基因位于牛20号染色体，由10个外显子和9个内含子组成，其碱基序列的突变可能导致其结构及功能的改变，进而影响到信号转导及生长激素作用的生理效应，最终影响产奶、产肉等经济性状。因此，将牛GHR基因作为候选基因，研究其与生产性能的关系，对牛的育种有很大实践意义[1,2]。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的SNP(coding SNP，cSNP)比较少，因为在外显子内，其变异率仅及周围序列的1/5。cSNP又可分为两种：一种是同义cSNP，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；另一种是非同义cSNP，即碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。这种改变常是导致生物性状改变的直接原因。本试验对牦牛GHR基因exon 10片段进行了SNP检测，旨在结合各乳成分数据研究该序列各SNP是同义突变还是非同义突变，是否影响各乳成分，为下一步将该遗传标记应用于牦牛泌乳性状的标记辅助选择(MAS)育种奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物来自青海省泽库县有机牧场，采集20头(胎次为2～3胎，年龄为6～7岁，产犊时间为当年4月底到5月初)泌乳牦母牛颈静脉血样5mL，干冰保存运往实验室，-20℃冷冻保存。

1.2 基因组DNA提取

基因组DNA提取采用柱式血液基因组DNA抽提试剂盒。提取后DNA采用分光光度计检测浓度和纯度。

1.3 引物序列及PCR反应程序

PCR引物设计参照NCBI 中登录号为AM161140.1序列，参考exon 10所在序列设计引物，引物序列如表1。

表1 牦牛exon 10 PCR扩增引物序列

PCR反应体系：DNA模板2μL，引物F、R 各2μL，dNTP 2μL，10×Taq buffer 5μL，Taq酶 0.5μL加ddH2O至50μL。

PCR反应条件：95℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环。循环3次，72℃修复延伸6min。

1.4 PCR产物回收测序

PCR产物切胶后经PCR产物回收试剂盒回收后冷冻，冷冻样品干冰保存送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序及检测SNP。

1.5 SNP多态性分析软件

用lasergene软件中SeqMan程序进行序列比对，用Chromas软件进行峰图比较。

2 结果与分析

2.1 牦牛GHR基因exon 10 序列PCR扩增结果

扩增exon 10分成两个片段扩增，左侧为引物P1扩增序列(990bp),右侧为引物P2扩增序列(742bp)。

2.2 牦牛GHR基因exon 10序列SNP多态性检测结果

本试验牦牛20头样本中发现GHR基因相对于普通牛GHR exon 10(Genebank登录号AM161140.1)AM161140.1-10第267位G，形成GG和AG两种基因型，AM161140.1-10第336位T，形成TT和GT两种基因型，AM161140.1-10第650位A，形成AA和AC两种基因型。AM161140.1-10第702位T(C/C型),第730位A(A/G型),第755位(T/T型),第810位T(C/T型)，第989位 T(C/C型)。本试验牦牛群体，共含SNP多态位点5个，第730位A(A/G型)，第810位T(C/T型)。

2.3 各SNP位点多态产生的基因型

SNP多态位点共形成4种基因型，见表2。

表2 牦牛GHR基因exon 10 SNP多态位点产生的基因型

所有样本形成4种基因型，GG/GT/AA/CC/AA/TT/CT/CC (基因型Ⅰ)1头、GG/TT/AC/CC/AG/TT/TT/CC(基因型Ⅱ) 5头、GG/TT/AA/CC/AA/TT/TT/CC 12头(基因型Ⅲ)，AG/TT/AA/CC/AA/TT/TT/CC (基因型Ⅳ)2 头，各基因型占比为1∶5∶12∶2，其中GG/TT/AA/AA/TT为优势基因型。

2.4 各基因型间乳成分平均值比较

表3 不同基因型间牦牛乳成分均值比较

2.5 不同基因型间方差分析

比较平均值后进行单因素方差分析，多重比较，假定方差齐型采用LSD法，未假定齐性方差采用Dunnett’s T3法，显著性水平设为0.05。

对不同组基因型各乳成分差异显著性分析结果表明，各基因型间乳成分差异不显著(P>0.5),即该基因SNP多态未产生对泌乳性状的影响。

3 讨论

3.1美国荷斯坦牛GWAS相关研究表明，20号染色体上包括C6基因和GHR基因的30.03～36.67 Mb 区域对产奶量影响显著[3]。非洲本土奶牛Kenana基因组重测序研究与产乳性状研究表明，CSN3、IGFBP-2、RORA、ABCG2、B4GALT1和GHR都是Kenana牛产奶性状的可选候选基因[4]。据先前被报道对高度选择的荷兰黑白花奶牛的产奶量和品质性状有影响的53个候选基因96个SNP中，GHR基因SNP对蛋白质和酪蛋白比例有影响[5]。Parmentier等[6]报道了GHR基因多态性与意大利荷斯坦奶牛的乳蛋白百分含量相关。Rahbar等[7]用PCR-RFLP法对伊朗荷斯坦奶牛GHR基因启动子区多态性与泌乳性状的相关性研究表明，Alu(+)基因型在第一泌乳期蛋白质和脂肪含量明显高于Alu(-/-)基因型。

3.2对该基因的研究热点主要集中在第8外显子，研究表明GHR基因第8外显子T/A替代，导致受体跨膜区出现F279Y氨基酸替换，对牛的乳产量和乳成分产生显著影响[8-12]。对中国荷斯坦牛GHR基因F279Y位点突变与产奶量的关联性研究结果表明，该突变位点与305d产奶量、乳脂率和乳蛋白率关联显著[13]。另有结果表明，AA型305d产奶量显著高于AT型，AT型305d乳脂量、305d乳蛋白含量和305d乳糖量在数值上有优于AA型的趋势，等位基因A为高产奶量的优势基因，等位基因T对乳成分有正效应，同时表明，GHR基因F279Y突变可作为遗传标记应用于中国荷斯坦牛泌乳性状的标记辅助选择育种[14]。王思伟等[15]研究了GHR基因F279Y位点对河北地区中国荷斯坦奶牛泌乳性能的影响，结果表明，该碱基突变对乳脂率的影响达到了显著水平，而对乳脂量、乳蛋白率、乳蛋白量和305 d产奶量影响不显著，TT基因型的乳脂率显著高于AA基因型，AA和TA、TT和TA基因型之间无显著差异。表明GHR基因该突变对河北地区中国荷斯坦奶牛泌乳性状有较大的遗传效应，可用于泌乳性状的分子标记辅助选择。Waters等[16]对32个假定的新GHR SNP和7个已发表的SNP(包括F279Y、1个外显子1A启动子和5个外显子)进行了848个Holstein-Friesian人工授精种公畜的基因分型。利用加权动物线性混合模型，对每一个分离SNP与表现遗传价值之间的关系进行了量化。6个已发表的SNP和7个新的SNP至少与其中一个性状有关——产奶量、脂肪产量、蛋白质产量、脂肪百分比、蛋白质百分比、体细胞分数、产犊间隔、存活和生长以及大小性状。GHR4.2和F279Y在848个Holstein-Friesians中不存在连锁不平衡，表明它们与产奶量的关系是独立的。

3.3有关牦牛GHR基因的研究报道较少，尤其是该基因对泌乳性能影响的研究较为罕见，仅限于该基因在牦牛不同组织中的表达及对生长性状影响的研究。基因水平和蛋白水平研究表明GHR在牦牛不同组织中的表达存在差异性，肝脏中的相对表达量最高，其次分别是心脏、肾脏、睾丸、肺脏和脾脏[17]。麦洼牦牛GHR基因SNP与体尺性状与关联性分析表明，第5、第10外显子和第6内含子中各发现一个SNP位点，而第5和第10外显子中的SNP为同义突变，并未导致氨基酸的变化。第5外显子SNP位点形成3种基因型TT/TC/CC，CC为优势基因型，且TT基因型个体的管围极显著高于TC和CC型，TC和CC型差异不显著[18]。有关牛GHR基因外显子10方面的研究，中国荷斯坦牛GHR基因外显子10 PCR-RFLP多态产生的AA型个体乳脂率显著高于BB型，AA型个体的体细胞数显著低于AB型个体，AA型为优势基因型，等位基因A可显著提高个体的乳脂率，降低个体体细胞数[19]。

3.4本研究中牦牛GHR 基因外显子10片段SNP产生的不同基因型间泌乳性状差异不显著，说明这些SNP可能为同义cSNP，突变碱基与未突变碱基的含义相同，即SNP所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，所以并未导致性状发生改变。该研究与海汀等[19]对麦洼牦牛GHR基因exon 10 中发现1个SNP的结论不同，但该片段SNP为同义突变的结论相似。因此，有关该片段方面的SNP应结合较大样本数量及不同群体进行深入研究。