苦荞粒重基因FtGW8的生物信息学分析

石桃雄 汪燕 黄娟 梁成刚

摘 要：种子大小和重量是荞麦产量构成的关键因素。该研究基于水稻粒重基因GW8，对苦荞粒重基因进行了生物信息学分析，结果表明，苦荞粒重FtGW8基因CDS序列长768bp，编码的蛋白质包含255个氨基酸，分子量为27.97kD，等电点为9.5，属于亲水性蛋白，具有跨膜结构，与水稻GW8蛋白相似。预测FtGW8蛋白定位于细胞核内，其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成，预测的三级结构与二级结构基本一致。蛋白功能分析发现，FtGW8和水稻GW8蛋白均具有SBP功能域，表明其可能具有控制粒重的功能。该研究为苦荞粒重基因的克隆奠定了基础。

关键词：苦荞;粒重基因;同源比对分析;蛋白质结构

中图分类号 Q74 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）15-0029-05

Bioinformatics Analysis of FtGW8 for Grain Weight in Tartary Buckwheat

SHI Taoxiong et al.

（Buckwheat Technology Research Center， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： Seed size and weight are the important factors for grain yield in Tartary buckwheat. In this study， bioinformatics analysis of the grain weight gene in Tartary buckwheat were conducted based on gene GW8 for grain weight in rice. The results showed that GW8 protein structure showed high similarity between Tartary buckwheat and rice. The CDS length of FtGW8 is 768 bp， encoding 255 amino acids. The molecular weight of the FtGW8 protein is 27.97 kDa， and the theoretical pI is 9.5. FtGW8 belongs to hydrophilic protein， and does not have transmembrane domain. Main composition of the secondary structure of FtGW8 were α-helix and random coil. It was predicted that FtGW8 mainly located in the nucleus. The result of prediction showed three-dimensional structure of FtGW8 was similar with the secondary structure. The analysis of protein function showed that both FtGW8 and rice GW8 had a SBP functional domain. The results suggested that FtGW8 might control grain weight in Tartary buckwheat. This study will lay the foundation for the further cloning of seed weight genes in Tartary buckwheat.

Key words： Tartary buckwheat; Gain weight gene; Homology analysis; Protein structure

荞麦（Fagopyrum Mill） 蛋白质含量高，富含黄酮类化合物，是我国特色药食兼用型小杂粮。荞麦包含甜蕎（Fagopyrum esculentum Moench）和苦荞（Fagopyrum tataricum Gaertn）两大栽培种[1-2]。与甜荞相比，苦荞总黄酮含量更高，抗氧化、降血脂、降血糖、降血压等保健功能更显著[3]。近年来，随着人们生活水平的提高和保健意识的增强，对苦荞的需求日也益增加。但目前苦荞产量低而不稳，且由于苦荞花朵较小，闭花受精，较难进行人工去雄和有性杂交工作，利用杂种优势提高产量较为困难[4]。因此，如何提高苦荞产量对于苦荞种植面积的推广和苦荞特色产业的发展尤为重要。

粒重由籽粒的长度、宽度、厚度决定，是作物的产量的决定性因素之一[5-6]，目前，水稻中已克隆出多个粒重相关基因[7-8]。水稻粒重基因GW8位于第8染色体，编码Squamosa启动子结合蛋白（squamosa promoter binding protein-like 16，OsSPL16），是一个包含SBP结构域的转录因子，GW8可加快颖壳细胞的纵向分裂速度而引起籽粒变长、穗长增加、子房伸长加快和籽粒灌浆加速，从而调控水稻粒和粒重[9]。GW8通过基因表达水平的变化调控粒型，较高的表达水平导致粒型变大，是粒型的正向调控因子[10]。目前，关于荞麦中粒重相关基因克隆的研究还鲜有报道。为此，本研究以水稻GW8粒重基因为参考，通过序列比对程序获得苦荞同源基因FtGW8，利用生物信息学方法和工具对FtGW8蛋白进行理化性质、结构及功能分析，为苦荞粒重基因FtGW8的克隆及分子功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 GW8基因序列的同源分析 首先，在国家水稻数据中心数据库中（http：//www.ricedata.cn/index.htm）获得水稻GW8基因序列（LOC_Os08g41940）和氨基酸序列。基于此氨基酸序列，通过Blastp（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）序列比对程序（参数默认）检索苦荞参考基因组蛋白数据库，将序列相似性最高的基因作为苦荞的GW8基因。在检索结果中，基因FtPinG0000496000.01编码的蛋白序列与水稻GW8蛋白序列的序列相似性最高，为54%，命名为FtGW8。

1.2 蛋白理化特性及结构预测 利用Gene Structure Display Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）预测基因结构。使用在线软件ExPASy-ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）预测分析蛋白质的理化性质（包括蛋白质的分子质量、等电点、氨酸组成、原子组成、脂肪系数、不稳定系数等）。使用在线软件NPS@：SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测蛋白质的二级结构。使用在线软件ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）对蛋白质进行疏水性分析。使用在线软件PHYRE2（http：//www.Sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）对蛋白质进行三级结构预测分析。使用iPSORT（http：//ipsort.hgc.jp/）、TargetP1.1Server（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/TargetP/）、WoLFPSORT（https：//wolfpsort.Hgc.jp/）对蛋白进行亚细胞定位。使用在线软件SignalP4.1Server（http：//www.Cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对蛋白进行信号肽预测。使用在线软件TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.Dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白跨膜区域预测分析。使用在线软件CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析蛋白的功能结构域。使用NetPhos3.1（http：//www.Cbs.Dtu.dk/services/NetPhos/）对目的基因进行磷酸化修饰位点预测。

2 结果与分析

2.1 苦荞FtGW8基因的序列 利用水稻GW8基因的氨基酸序列在苦荞参考基因组数据库进行BLAST分析，筛选获得与水稻GW8相似度最高（54%）基因FtPinG0000496000.01的CDS序列，暂时命名为FtGW8。FtGW8基因CDS全长768bp，编码的蛋白含255个氨基酸。利用GSGD2.0在线软件对FtGW8基因的DNA和CDS序列进行分析，获得FtGW8基因结构图（见图1），结果表明，该基因含有3个外显子和2个内含子。与水稻GW8基因结构的比对发现，FtGW8基因与水稻GW8基因结构基本一致（见图2）。

2.2 荞麦FtGW8蛋白的结构与功能

2.2.1 FtGW8蛋白质的理化性质 对FtGW8的氨基酸组成进行预测，结果表明：苦荞FtGW8的氨基酸组成中，丝氨酸（Ser）含量最高，占16.1%，其次为甘氨酸（Gly），占9.0%，含量最低的为色氨酸（Trp），占0.8%，缺少吡咯赖氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）2种氨基酸（见表1）。对FtGW8蛋白质理化性质分析表明，该蛋白分子量为27.97 kDa，理论等电点为9.5，分子式为C1190H1881N375O376S16，不稳定系数为68.06，说明该蛋白可能为不稳定蛋白（不稳定系数>40）。FtGW8蛋白质平均疏水性为-0.74（见表2），且氨基酸峰值在0以下比例明显大于0以上的（见图3），表明该蛋白可能为亲水性蛋白。

2.2.2 FtGW8蛋白质的二级结构 利用NPS@：SOPMA。在线软件获得苦荞FtGW8蛋白的二级结构构成图（图4）表明，FtGW8蛋白主要由α-螺旋、無规则卷曲、β-转角和延伸链4种构象组成，其中有136个氨基酸（占总氨基酸数的53.3%）参与构成无规则卷曲（Cc），氨基酸的占比最高;其次是α-螺旋（Hh），由61个氨基酸构成，占总氨基酸数的23.92%;延伸链（Ee）和β-转角（Tt）比例较少，分别占18.04%（46个氨基酸）、4.71%（12个氨基酸）。

2.2.3 FtGW8蛋白质的三级结构 利用在线软件Phyre2，建模预测苦荞FtGW8蛋白的三级结构（见图5）。由图5可知，FtGW8蛋白与PDB晶体库中的GW蛋白模体（PDB号：d1s70a）最为同源，可信度达到100%。因此，推测苦荞FtGW8蛋白的三级结构是由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成，这一结构与二级结构预测结果基本一致。

2.2.4 FtGW8蛋白质的亚细胞定位 利用WoLFPSORT Prediction预测FtGW8蛋白定位于细胞核的系数为12（nucl：12），定位于叶绿体的系数为1（chlo：1），定位于其他细胞器的系数为1（extra：1）。使用iP-SORT在线软件预测FtGW8的亚细胞定位，其结果如图6所示。从图6可以看出，该蛋白不在叶绿体或线粒体中，也不含信号肽。综上推测，苦荞GW8蛋白位于细胞核的可能性较大。

2.2.5 FtGW8蛋白的信号肽 使用在线软件SignalP 4.1对苦荞FtGW8蛋白进行信号肽分析，得到剪切位点系数（C-score）、综合剪切位点系数（Y-score）、S信号肽系数（S-score）的值均为0（见图7），说明FtGW8蛋白没有包含信号肽。

2.2.6 FtGW8蛋白的跨膜结构 跨膜结构域一般是20个左右的疏水氨基酸形成的α螺旋结构，在细胞膜上起锚定作用，是膜内蛋白与膜脂相结合的主要部位。对蛋白跨膜结构域的预测和分析，有助于了解蛋白的功能、结构及细胞中的作用部位[11]。利用TMHMM Server v 2.0对FtGW8蛋白跨膜性预测，结果表明，GW8蛋白肽链全部位于膜外，不具有跨膜结构（见图8）。

2.2.7 FtGW8蛋白的结构域 使用CD-search在线预测FtGW8蛋白的功能结构域发现，该蛋白与水稻的结构域基本一致[9]，在第21～95个氨基酸中含有一个SBP功能域（SQUAMOSA-promoter binding protein）（见图9）。

2.2.8 FtGW8蛋白的磷酸化修饰位点的预测分析 蛋白质磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰方式之一，几乎参与所有的生物学过程[12]。使用NetPhos 3.1预测FtGW8蛋白的磷酸化修饰位点，结果显示，该蛋白共有37个磷酸化位点，其中Ser（丝氨酸）30个，Thr（苏氨酸）4个，Tyr（酪氨酸）3个（见图10）。

3 讨论与结论

粒重是影响作物产量的主要因素之一，而且是一个由多个基因与环境协同作用、共同控制的复杂数量性状。解析作物的粒重、粒长、粒宽及粒厚的遗传调控机理，对分子辅助高产育种有着重要意义。目前，在水稻[13-14]、玉米[15]、小麦[16]、高粱[17]等作物中已有一些关于粒重和粒型基因的相关报道。已克隆得到的水稻粒重GW8基因编码一个含有SBP功能域的Squamosa启动子结合蛋白OsSPL16，GW8能直接结合到GW7基因的启动子并调控其表达，GW8-GW7分子模块在水稻粒重的调控中起正向调节因子的作用，在提高水稻产量的同时提高了稻米品质[9]。本研究以水稻粒重GW8氨基酸序列为模板进行同源分析，获得了苦荞FtGW8蛋白。通过生物信息学分析发现，该蛋白是由255个氨基酸组成，分子量为27.97kD的亲水性蛋白，其主要由α螺旋和无规则卷曲构成，不具有信号肽，亚细胞定位软件预测其定位于细胞核中。蛋白功能预测显示，FtGW8蛋白含有一个SBP结构域。这些预测结果与水稻GW8的蛋白结构功能一致。

本研究发现，苦荞FtGW8蛋白与水稻GW8蛋白具有相同的保守结构域SBP，由此推测苦荞FtGW8基因和水稻GW8基因具有相似的功能，即具有控制粒宽和粒重的功能。目前，水稻粒重调控基因GW8的荧光分子标记已开发出来，为在水稻中快速准确鉴定其基因型提供了技术支持。考虑到FtGW8对提高苦荞产量的巨大潜在作用，在今后的研究中，一方面，有必要对FtGW8及基因家族的功能进行深入研究，为苦荞产量性状的遗传改良提供基础和理论支撑;另一方面，应借鉴水稻的做法，基于KASP等现代分子标记技术，开展基于基因的关联分析，挖掘优异的FtGW8等位基因，开发FtGW8的标记，为苦荞分子标记辅助高产育种提供标记支撑。

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（责编：张宏民）

基金项目：国家自然科学基金项目（32060511）;贵州省科技支撑项目（黔科合ZC[2019]2298）;贵州省荞麦种质资源保育及创新重点实验室建设基金（黔教合KY[2017]002）。

作者简介：石桃雄（1980—），女，宁夏人，博士，副教授，研究方向：荞麦种质资源与育种。 *通讯作者  收稿日期：2021-04-26