莪术基原植物DNA条形码序列的筛选与鉴定

张玉秀 刘杨 刘培卫 符传坤 卢丽兰 魏建和

摘 要：为寻找适用于中药材莪术基原植物鉴定的DNA条形码序列，探索快速高效的莪术基原植物鉴定的新方法，该文首先利用扩增成功率和测序成功率对中药材莪术三种基原植物，9个样本的7种DNA条形码序列（ITS、ITS2、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、rpoB 和atpB-rbcL）进行评估，然后利用MEGA6.0软件对获得的高质量的序列通过变异位点分析、遗传距离计算和系统树分析等进一步进行评估，最后将筛选到的DNA条形码序列对未知基原的待测样品进行基原鉴定。结果表明：（1）ITS、ITS2和matK等条形码序列在莪术基原植物中的扩增或测序成功率较低，难以应用于实际鉴定;而psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB条形码序列变异位点信息过少，不足于区分莪术的三种不同基原植物;只有atpB-rbcL条形码序列的扩增和测序成功率较高，容易获得高质量的序列，同时序列长度（642～645 bp）理想，变异位点多（11个），可实现莪术的三种不同基原的区分鉴别。（2）待测样品经基于atpB-rbcL序列构建的系统发育树鉴别为温郁金。综上所述，叶绿体atpB-rbcL序列能够准确鉴定莪术不同基原植物，可以作为中药材莪术基原植物鉴定的条形码序列。

关键词：莪术，DNA条形码，筛选，atpB-rbcL，基原植物鉴定

中图分类号：Q943.2

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2021）08-1263-07

Abstract： In order to find a rapid and efficient identification method for three original species of Curcumae Rhizoma， identification efficiency of different DNA barcoding sequences were evaluated in present study. Totally nine samples of three different species of Curcuma were collected. After DNA extraction， PCR amplification and sequencing， seven kinds of DNA barcoding sequences， including ITS， ITS2， matK， psbA-trnH， trnL-trnF， rpoB and atpB-rbcL， were firstly compared in terms of success rate of PCR amplification and characteristics of sequences. Then， by means of variation site analysis and genetic distance calculation， these seven kinds of DNA barcoding sequences were further evaluated. Finally， the unidentified samples were identified by the phylogenetic tree based on the chosen DNA barcoding sequences. The results were as follows： （1） ITS， ITS2 and matK barcoding sequences were inapplicable due to the low success rate of PCR amplification and sequencing; The variation information of psbA-trnH， trnL-trnF and rpoB was insufficient to distinguish three different original species of Curcumae Rhizoma; Only atpB-rbcL barcoding sequence was 642-645 bp in length with 29.0%-29.9% GC content and 11 variation sites， for which， the three species of Curcumae Rhizoma could be distinguished only by atpB-rbcL barcoding sequence. （2） According to the phylogenetic tree based on atpB-rbcL sequence， the unidentified samples were identified as Curcuma wenyujin. In conclusion， atpB-rbcL sequence could be used as a standard sequence for the rapid and efficient identification of original species of Curcumae Rhizoma.

Key words： Curcumae Rhizoma， DNA barcode， screening ， atpB-rbcL， original plant identification

中藥材莪术由广西莪术（Curcuma kwangsiensis）、蓬莪术（C. phaeocaulis）和温郁金（C. wenyujin）的根茎加工而成，为我国常用中药材，具有行气破血、消积止痛等功效（中国药典，2015）。现代研究表明，不同来源莪术的化学成分和药效存在较大差异（吴伯英和李敏，2012）：莪术二酮、莪术醇、吉马酮和β-榄香烯等主要有效成分含量在不同来源莪术中有明显差异（毛春芹等，2013）;药效实验表明温郁金治疗胃癌和肝癌效果最好（唐德才等，2013;臧文华等，2014），妇科药保妇康栓的主要成分莪术油主要来源于温郁金（张永文和杨瑞琦，2010）。随着国内外市场对莪术需求量的日益增大，人工种植莪术已成为莪术药材的主要来源（吴正强和赵小文，2003），为保证栽培选种正确，临床用药安全有效，莪术基原植物的准确鉴别亟待解决。

广西莪术、蓬莪术和温郁金均为姜黄属（Curcuma L.）植物，该属植物的传统鉴别主要基于花或叶片等的形态特征（中国植物志，2004;Záveská et al.， 2012;沈荔荔等，2014）。莪术三种基原植物形态特征类似极易混淆，依靠形态特征的传统鉴定和分类比较困难（中国植物志，2004;肖小河等，2004），而人工栽培以及各地相互引种等因素加剧了分类的不确定性，因此，有必要确定各地种植莪术的基原和种质以保证正确种植。各学者分别运用显微鉴别、理化鉴别、RAPD分析和化学指纹图谱（肖小河等，2000，2001;沈艳等，2014;杨丰庆等，2005;刘双利等，2016）等对莪术基原植物进行了研究，但上述方法在实际应用中仍存在不少困难或因序列太长而大大增加了应用的难度（曹晖等，2010）。

本研究通过对多种DNA条形码序列进行筛选，建立了适用于莪术三种基原植物的DNA条形码技术鉴定方法，同时也为姜黄属植物的分类和鉴定提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验共收集14份材料，包括9份试验样本和5份待检样本。蓬莪术、广西莪术和温郁金分别采自温州、广西、四川等道地产区，待测样本采自海南和江西等引种地，具体信息见表1。材料由中国医学科学院药用植物研究所海南分所朱平老师鉴定。

1.2 方法

1.2.1 样品 DNA 的提取、扩增和测序 每个样品取100 mg新鲜叶片，参照植物基因组DNA提取试剂盒（OMEGA HP Plant DNA Kit，美国）提取DNA。提取后的总DNA用微量核酸蛋白测定仪（Thermo，美国）进行质量检测。PCR扩增使用的引物和扩增程序参照相关文献（表2）。PCR反应体系为25 μL，其中，2x EcoTaq PCR SuperMix（Transgen， 中国） 12.5 μL，正反引物各1 μL，DNA模板20 ng。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。扩增成功的PCR产物送到华大基因公司纯化，并双向测序。

1.2.2 数据处理 利用 CodonCode Aligner V2.0 （CodonCode Co.，美国）对测序峰图进行校对拼接，去除低质量序列及引物区，应用相似性搜索法（BLAST）进行防错，将正确的有效序列在GenBank注册新序列号（表1）。运用MEGA6.0 进行多序列比对，计算种内或种间 Kimura 2-parameter （ K2P）遗传距离并构建NJ系统树。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增和测序

ITS、ITS2序列的PCR成功率虽可达到100%，但其测序峰图表现为多位点的无规则套峰，无法得到准确单一的序列。matK的平均扩增成功率仅为18.75%。psbA-trnH、 rpoB、trnL-trnF和atpB-rbcL的PCR扩增效率和测序成功率都为100%，序列长度介于325～645 bp之间，psbA-trnH和ropB的变异位点为0，trnL-trnF有1个变异位点，atpB-rbcL在14个样品间有11个变异位点（表3）。

2.2 atpB-rbcL序列特征分析

通过对atpB-rbcL序列比较发现，蓬莪术的atpB-rbcL序列长度为642 bp，温郁金和广西莪术的序列长度均为645 bp。广西莪术与温郁金相比，仅在550位点上存在一个C到T转换，而与蓬莪术相比存在8处碱基的不同，例如在76位点C到T转换，259位点T插入，310位点C到T转换，397位点C到T转换，430位点4个碱基T缺失等。待测样品中，江西新余、海南澄迈和临高的atpB-rbcL序列与温州温郁金的一致性为100%，只有海南琼山与温州温郁金的atpB-rbcL序列存在一个碱基变异。

2.3 遗传距离计算及基于atpB-rbcL序列的系统进化树

应用MEGA6.0软件，基于K2P距离模型计算莪术不同基原植物间的遗传距离。其中广西莪术种内遗传距离均为0，温郁金的种内遗传距离为0.000 4，蓬莪术的种内遗传距离为0.006 3;温郁金与广西莪术种间的平均遗传距离为0.001 8，温郁金与蓬莪术之间的平均遗传距离均为0.008 1，广西莪术和蓬莪术种间的遗传距离平均为0.009 5。待测样品中，海南样品和温州产温郁金的遗传距离在0～0.001 6之间，平均遗传距离为0.000 5，江西样品和温州产温郁金的遗传距离均为0。

应用MEGA6.0软件构建基于atpB-rbcL序列的广西莪术、温莪术和蓬莪术的NJ系统树（图1）。在NJ系统树上，温郁金3个居群、广西莪术4个居群和蓬莪术2个居群分别聚为单系分支，其中温郁金和广西莪术合聚为一大支，蓬莪术单独聚为一支，表明基于atpB-rbcL序列构建的NJ系统树可将温郁金、广西莪术、蓬莪术三個物种明显分开，而温郁金与广西莪术的关系较近而与蓬莪术关系较远。待测样品都与温州产温郁金聚在同一分支（图1）。

3 讨论与结论

DNA条形码技术自2003年提出以来，已成为全球生物分类研究的热点和方向（陈士林等，2013）。由于植物的核苷酸进化速率低于动物，且植物存在更多杂交和多倍化的进化事件，植物中没有一个单独的片段能像动物COI一样成为高效和通用条形码。因此，筛选一个或多个适合植物分类的DNA条形码序列成为十分重要的研究内容（Chen et al.，2010; Group et al.，2011）。本研究在ITS、ITS2、atpB-rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF和rpoB等7条DNA条形码候选序列中，从PCR扩增的难易程度，测序成功率和变异程度等方面，筛选到了一条适宜鉴定莪术基原植物DNA条形码序列atpB-rbcL。

核基因ITS和ITS2在莪术类植物间的测序成功率很低，Chen et al.（2014）认为这主要是由于多倍体杂交和多年人工栽培造成的。虽可通过构建单克隆载体的方式得到ITS2序列，但这无疑增加了成本和难度，且在姜黄属内能提供分辨率仅为46.7%（Chen et al.， 2014）。matK是植物DNA条形码研究的核心条形码序列之一（Leister et al.，1998），但它在本研究的样本中PCR扩增效率最低（18.75%），类似的问题在其他植物中也多有报道（Sass et al.， 2007;Hollingsworth et al.， 2009;Chen et al.， 2014）。Chen et al.（2014）利用多对引物和多次摸索后，将姜黄属matK序列扩增成功率提高至85.4%，却发现姜黄属matK序列不存在barcode gap（Chen et al.，2014）。我们利用其序列进行分析，发现matK序列不能将莪术不同基原植物分开。从PCR扩增效率和测序成功率考虑，我们认为matK、ITS和ITS2这三条序列不适宜作为莪术基原植物鉴定的候选序列。

psbA-trnH、ropB、trnL-trnF和atpB-rbcL这四条序列在本研究中的扩增和测序成功率均为100%，但前三个序列在这些样本中极度保守、进化速率慢，其种间差异为零或差异极小，而atpB-rbcL存在丰富的变异。因此，我们将其作为莪术不同基原植物鉴定的适宜序列。在此基础上，本研究基于atpB-rbcL序列，通过计算遗传距离和构建NJ系统树，将《中国药典》中莪术的三种基原植物明显区分开，同时鉴定结果说明海南和江西引种的样品都为温郁金。近年来海南种植莪术的规模越来越大，本文利用DNA条形码技术，将海南引种的莪术基原植物鉴定为温郁金，为其合理的开发和利用提供了保障。

本研究对莪术基原植物的DNA条形码鉴定进行了初步的探讨，筛选获得的atpB-rbcL序列对莪术不同基原植物的快速准确鉴定具有重要意义，但莪术基原植物的栽培品种众多，且分布范围广，因此，进一步扩大取样范围十分必要。本研究可为莪术基原植物的品种选育、引种栽培等提供可行的方法，同时，也为姜黄属植物的分类和鉴定提供借鉴。

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（责任编辑 李 莉）