生长素输出载体蛋白PIN1在作物根和胚中的亚细胞定位

武丽霞 韩丽 赵宜婷 周璇 杜云龙

摘 要：生長素输出载体在植物发育中起非常重要的作用。然而，生长素输出载体蛋白PIN1在农作物水稻、小麦、玉米和大豆的根和胚中的亚细胞定位尚不清楚。该研究首先分析了OsPIN1b和它的同源物的氨基酸序列特征，发现小麦（TaPIN1）、玉米（ZmPIN1b）和大豆 （GmPIN1b）中的PIN1序列与水稻的OsPIN1b序列分别具有61.5%、62.5%、61.9%的相似性。然后根据水稻‘日本晴（‘Nipponbare）的OsPIN1b的氨基酸序列，人工合成OsPIN1b多肽并注射健康的新西兰白兔获得了抗兔的OsPIN1b多克隆抗体，在通过免疫印迹方法检测抗兔的OsPIN1b多克隆抗体的有效性后，发现可以利用该抗体有效检测到水稻叶片及根中OsPIN1b的表达。为检测OsPIN1及其同源物在不同作物胚根和胚中子叶细胞的定位，利用制备的抗兔的OsPIN1b多克隆抗体并通过免疫组化实验，发现水稻的OsPIN1b、小麦的TaPIN1和玉米的ZmPIN1b非极性定位在早期的胚根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上，大豆中的GmPIN1b非极性定位在胚根表皮细胞的质膜上，而在胚的子叶细胞中是胞质定位。为进一步检测水稻中OsPIN1b的亚细胞定位，对水稻根分生区表皮细胞用蛋白质转运抑制剂BFA （Brefeldin A）及抗兔的OsPIN1b多克隆抗体处理后，进行免疫组化实验，结果发现水稻中的OsPIN1b可以通过胞吞转运途径从水稻根表皮细胞膜进入细胞质中。该研究利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体有效检测了OsPIN1b及其同源物在水稻、小麦、玉米和大豆的胚根表皮细胞及胚中子叶表皮细胞的亚细胞定位，这将有助于进一步揭示生长素输出载体OsPIN1b及其同源物通过调控生长素极性运输而参与作物发育的作用机制。

关键词：生长素输出载体，PIN1，水稻，小麦，玉米，大豆

中图分类号：Q943

文献标识码：A

文章编号：1000-3142（2021）08-1219-07

Abstract： Auxin efflux carrier plays an extremely important role in plant development. However， the subcellular localization of auxin efflux carrier PIN1 in the roots and embryos of crops rice， wheat， maize and soybean remains unclear. In this study， the characterization of OsPIN1b and its homologous amino acid sequence were analyzed， and it showed that the PIN1 sequences of wheat （TaPIN1）， maize （ZmPIN1b） and soybean （GmPIN1b） shared 61.5%， 62.5% and 61.9% similarities with rice OsPIN1b， respectively. Next， an artificial OsPIN1b polypeptide was synthesized based on the OsPIN1b amino acid sequence of rice ‘Nipponbare and injected it into healthy New Zealand white rabbits to obtain anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody. The effectiveness of the prepared polyclonal antibody against OsPIN1b was detected by immune blot method， and the expression of OsPIN1b was found to be effectively detected in rice leaves and roots. Furthermore， the subcellular localization of OsPIN1b and its homologous in primary roots and cotyledon cells of embryos in different crops was detected with anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody by immunohistochemistry assay. The results showed that rice OsPIN1b， wheat TaPIN1 and maize ZmPIN1b apolarly localized on the plasma membrane of epidermal cells of primary roots and cotyledon of embryo in rice， wheat and maize grown in early development stages， and soybean GmPIN1b apolarly localized on the plasma membrane of primary root epidermal cells， but was cytosolic localization in the cotyledon cells of embryo. To further detect the subcellular localization of OsPIN1b， epidermal cells of rice primary root meristem region were treated with protein transport inhibitors BFA （Brefeldin A） and anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody and detected by immunohistochemistry assay. It showed that OsPIN1b localized on cytoplasma membrane of rice root epidermal cells could enter into the cytoplasm via endocytic trafficking manner. In this study， the subcellular localization of OsPIN1b and its homologous in the epidermal cells of primary roots and cotyledons of embryos of rice， wheat， maize and soybean were effectively detected with the anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody， and it will facilitate us to reveal the molecular mechanism of auxin efflux carrier OsPIN1b and its homologous by regulating polar auxin transport to involve in crops development.

Key words： auxin efflux carrier，PIN1，rice，wheat，maize，soybean

生长素输出载体蛋白在调节植物生长素极性运输中起重要作用。生长素极性运输参与胚胎形态发生（Blilou et al.， 2005）和侧生器官的形成（Casimiro et al.， 2001）。拟南芥基因组中的PIN基因家族编码PIN1-8的8种生长素输出载体蛋白（Friml et al.， 2003; Benjamins & Scheres， 2008）。PIN蛋白可以通过内吞作用转运到细胞质中，并形成循环小泡返回质膜（Geldner et al.， 2001）。 Atpin1 突變体植株表现出针状花序并且花和维管组织发育表现明显缺陷（Glweiler et al.， 1998）。AtPIN1的极性定位还影响胚胎的发育（Friml et al.， 2003）。AtPIN1分布于维管组织（Glweiler et al.， 1998）、木质部薄壁组织（Glweiler et al.， 1998; Palme & Glweiler， 1999）、根表皮和皮层细胞（Blilou et al.， 2005）、分生组织表皮和原基表皮 （Guenot et al.， 2012）的细胞质中。但是，目前人们对单子叶植物和双子叶植物之间PIN1蛋白的亚细胞定位差异仍不清楚。

AtPIN1的同源基因可以存在于水稻（Xu et al.， 2005; Li et al.， 2019）、小麦（Singh et al.， 2018）、玉米（Gallavotti et al.， 2008）和大豆（Wang et al.， 2015）的基因组中。在水稻的维管组织和根原基中可以检测到OsPIN1的表达（Xu et al.， 2005），OsPIN1以生长素依赖性的方式参与水稻根、茎、花序和分蘖的发育（Xu et al.， 2005; Li et al.， 2019）。ZmPIN1a主要定位在玉米幼苗的上叶原基（Gallavotti et al.， 2008）、根中的中柱鞘细胞和内皮层细胞（Carraro et al.， 2006）、胚芽鞘（Kamada et al.， 2018）和叶片（Moon et al.， 2013）的表层细胞。此外，ZmPIN1a在根冠细胞中显示为胞质定位（Forestan et al.， 2012），在花序初生原基细胞中显示为非极性定位 （Skirpan et al.， 2009）。但是，目前尚不清楚PIN1在不同作物的根和胚中的亚细胞定位，包括水稻、小麦、玉米和大豆。

在这项研究中，我们基于水稻‘日本晴（‘Nipponbare）的OsPIN1b氨基酸序列，制备了抗兔的OsPIN1b多克隆抗体，利用该抗体开展的免疫组化实验发现水稻的OsPIN1b及小麦和玉米中的同源蛋白可以非极性定位在根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上，而大豆的GmPIN1b可以非极性地定位在根中表皮细胞的质膜上，但是，在胚的子叶表皮细胞中是细胞质定位。此外，水稻根表皮细胞质膜上的OsPIN1b可以通过内吞运输途径进入到细胞质中。这些PIN1定位结果将有助于我们研究生长素极性运输在水稻、小麦、玉米和大豆作物发育中的作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料

植物材料为水稻品种‘Nipponbare和‘丽江新团黑谷（‘LTH）（Oryza sativa subsp. japonica）、小麦（Triticum aestivum ‘Chuanmai107）、玉米（Zea mays ‘B73）和大豆（Glycine max ‘Williams），各作物种子置于28 ℃条件下水培萌发，使用生长了7 d的胚根分生区细胞和1 d的子叶胚来检测OsPIN1b及同源物的亚细胞定位。

1.2 抗体的制备和检测

根据水稻‘Nipponbare的生长素输出载体OsPIN1b（Os02g0743400）的氨基酸序列人工合成多肽QSSRNPTPRGSSFNC，并将其注入新西兰兔体内。通过ELISA方法检测到纯化的抗兔OsPIN1b多克隆抗体，其浓度为0.51 mg·mL-1（1∶20 000）（杭州华安生物技术有限公司）。

1.3 免疫杂交和免疫组化检测

为检测OsPIN1b的表达，提取了水稻叶片和根的总蛋白，并用一抗[抗兔的OsPIN1b多克隆抗体（1∶200）]和二抗[山羊抗兔的IgG-HRP（1∶5 000）]进行了免疫杂交。为了检测蛋白亚细胞定位，使用或不使用50 mmol·L-1 Brefeldin A（BFA）（molecular probes）对不同农作物的根和胚处理90 min，然后使用改良的免疫组织化学分析方法进行检测（Paciorek et al.， 2006）。具体如下：首先，将样品在25 ℃室温条件下用4%戊二醛溶液固定1 h;然后，37 ℃条件下用2%崩溃酶处理1 h;最后，用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体（1∶200）和二抗[驴抗兔的IgG（H+L）-Alexafluor 488抗体（1∶500）]（Jackson ImmunoResearch）进行免疫组化检测。使用Leica SP5激光共聚焦显微镜（Leica Microsystems）观察OsPIN1b的定位。

1.4 生物信息学分析

从NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得OsPIN1b及其同源蛋白的氨基酸序列，通过在线网站（https：//www.uniprot.org/）分析OsPIN1b的跨膜结构域，使用软件Vector NTI Suite 6进行氨基酸序列比对，所有图片均使用Photoshop软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同作物的PIN1序列相似性分析

为了检测不同作物中生长素输出载体蛋白PIN1的亚细胞定位，首先，我们对拟南芥（AtPIN1）、水稻（OsPIN1b）、小麦（TaPIN1）、玉米（ZmPIN1b）和大豆（GmPIN1b）中PIN1的氨基酸序列进行比对分析（图1）。结果表明：AtPIN1、TaPIN1、ZmPIN1b、GmPIN1b的序列与OsPIN1b分别具有58.6%、61.5%、62.5%、61.9%的相似性，在OsPIN1b的氨基酸序列中存在10个跨膜区。

2.2 水稻中OsPIN1b的检测

PIN1序列在水稻、小麦、玉米和大豆之间显示出高度相似性（图1）。我们选择OsPIN1b中的序列QSSRNPTPRGSSFNC，通过人工合成多肽免疫兔子制备了抗兔的OsPIN1b多克隆抗体。为检测抗兔的OsPIN1b多克隆抗体的有效性，我们提取了水稻叶片和根的总蛋白，并使用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体进行免疫杂交检测。结果表明，用OsPIN1b抗体可以检测到目标蛋白OsPIN1b（图2）。

2.3 PIN1在不同农作物中的亚细胞定位通过免疫组织化学分析进一步检测了水稻、小麦、 玉米和大豆根中PIN1的亚细胞定位，发现PIN1虽然可定位于根表皮细胞的细胞质膜上，但没有明显的极性分布（图3：A-D）。在检测PIN1在胚细胞中的定位时，发现PIN1虽然可分布在水稻（图3：E）、小麦（图3：F）和玉米（图3：G）胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上，但没有明显的极性分布。大豆中的GmPIN1b非极性分布在根表皮细胞的细胞质膜上，而在胚的子叶表皮细胞中则分布于细胞质中（图3：H）。

2.4 水稻中OsPIN1b的胞吞检测

由于OsPIN1b蛋白定位于细胞质膜上（图3：A，E），因此，我们进一步检测了OsPIN1b是否可以通过胞吞的方式从细胞质膜转运入细胞质。用蛋白转运抑制剂BFA处理水稻‘Nipponbare和‘LTH的根尖，用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体开展免疫组织化学实验，结果发现在细胞质中可以检测到OsPIN1b蛋白的聚集（图4）。这表明OsPIN1b可以通过胞吞途径从细胞质膜转移到细胞质中。

3 讨论与结论

生长素输出载体蛋白PIN家族在植物发育中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体有效检测了水稻、小麦、玉米和大豆的胚根分生区表皮细胞及胚中子叶表皮细胞的OsPIN1及其同源物的亚细胞定位，结果发现OsPIN1b及其同源物分布在水稻、小麦、玉米和大豆的根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜及细胞质中。不同作物中的相同细胞定位表明PIN1在不同植物发育中，其调节生长素分布功能是保守的。此外，我们也注意到与拟南芥AtPIN1的极性定位相比（Friml et al.， 2003），在不同农作物的根表皮细胞中，OsPIN1及其同源物的定位是非极性的。OsPIN1b的氨基酸序列与AtPIN1具有58.6%的相似性，因此，不同作物和拟南芥AtPIN1蛋白的亚细胞定位模式存在的差异可能与不同植物中PIN1蛋白结构差异有关。玉米中的ZmPIN1a在不同玉米组织中的定位存在极性定位（Carraro et al.， 2006; Gallavotti et al.， 2008; Moon et al.， 2013; Kamada et al.， 2018）、非极性定位 （Skirpan et al.， 2009）和胞质定位 （Forestan et al.， 2012），一些研究也发现AtPIN1的极性分布与胚发育中的生长素动态相关（Friml et al.， 2003）。在本研究中，用于OsPIN1b及其同源物细胞定位观察的胚根及子叶胚都处于植物发育的早期阶段，这表明不同作物中PIN1的定位还与作物组织发育阶段有关。此外，利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗体可以检测到OsPIN1b蛋白。进一步分析结果发现OsPIN1b与OsPIN1a氨基酸序列相似性为62.4%，OsPIN1a、OsPIN1b蛋白分子量分别为64.7、59.3 kD，且OsPIN1a氨基酸序列中含有用于制备抗兔的OsPIN1b多克隆抗体的序列QSSRNPTPRGSSFNC。因此，不能完全排除所检测到的蛋白条带中含有OsPIN1a，而这也可能部分解释了我们在根表皮细胞中所观察到的OsPIN1b及其同源物的非极性定位。

PIN蛋白由于胞吞作用而产生的细胞定位的改变可影响生长素的极性运输，从而进一步调控器官形成（Kleine-Vehn et al.， 2008）。本研究結果发现OsPIN1b可以通过胞吞途径进入到细胞质中。这显示由于细胞的胞吞作用，OsPIN1b及其同源物的细胞质膜及细胞质定位可能会发生变化，并参与调控植物内生长素的分布。PIN蛋白的细胞定位可受到其他物质如水杨酸的调控（Du et al.， 2013）。但是，我们观察到OsPIN1b的定位可由自身胞吞作用而改变，因此，不同作物中PIN1蛋白的亚细胞定位是一个动态的过程。

不同作物中OsPIN1b及其同源物可非极性定位于细胞质膜及细胞质中，这是一个动态的分布过程，并与植物所处的发育阶段密切相关。OsPIN1b及其同源物的亚细胞定位将有助于揭示生长素输出载体通过影响生长素极性分布而参与调控农作物中根和胚发育的分子机制。

登录号 文章中相关蛋白在NCBI数据库中的登录号分别为AtPIN1 （NP_177500.1）、OsPIN1b （XP_015616014.1）、TaPIN1 （AAS19858.1）、ZmPIN1b （ABH09243.1）、GmPIN1b （NP_001237546.2）。

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（責任编辑 周翠鸣）