基于PI3K、Akt信号通路探讨山腊梅叶乙醇提取物的降糖降脂作用

潘建萍，凌志杰，李明

赣南卫生健康职业学院，江西 赣州 341000

2型糖尿病作为临床目前多发、常见的慢性代谢疾病，发病机制与遗传因素、年龄因素、生活方式及饮食习惯等多种因素密切相关，其主要发病特点是糖代谢异常[1-4]。同时，由糖尿病引发的血脂异常，也是引发心脑血管等重要脏器疾病的重要因素[5-6]。其中胰岛素受体底物-1（IRS-1）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）信号通路是胰岛素调节血糖平衡的关键途径，它在机体葡萄糖利用转化等生理功能中发挥关键作用，具有改善机体血糖、血脂代谢等作用[7-8]。《本草纲目》中记载：山腊梅有清热解毒、健胃消食之效，同时Chen Hui等[9]研究中发现山腊梅叶总乙醇提取物具有降血脂、降血糖和抗氧化等作用，这也预示着其可能具有降糖作用，但具体作用机制有待于进一步研究。该文基于IRS-1、PI3K、AKT传导通路研究，探讨山腊梅叶乙醇提取物对高脂高糖糖尿病大鼠血糖血脂的作用及机制，以期能够为临床有效用药提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

取Wistar雄性大鼠75只，年龄7周龄左右，体质量平均（240±20）g，大鼠的大小、年龄、体重等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。按照国家标准啮齿类动物干燥饲料喂养，自由摄食、饮水。大鼠饲养环境保持安静，室温调节在22～30℃、湿度调控在40%～70%。

1.2 山腊梅叶提取

实验药物取江西佑美山腊梅基地山腊梅叶进行乙醇提取。将干燥山腊梅叶粉碎后，经多功能提取罐热回流提取，用10倍体积80%乙醇在60℃温度条件下反复提取2次，3 h/次。提取液经减压回收溶剂后真空干燥，得到乙醇提取物浸膏。

1.3 构建高脂高糖大鼠模型

利用高脂高糖饲料喂养+腹腔注射小剂量STZ以此构建高血糖、高脂血症的2型糖尿病大鼠[10-11]。先用高脂高糖饲料喂养4周，使动物处于糖尿病前期的轻微的胰岛素抵抗状态，后4周根据大鼠体质量，高脂高糖饲料喂养组腹腔注射40 mg/kg柠檬酸缓冲液溶解（STZ），并持续喂养高脂高糖饲料。注射3 d后，自尾静脉采血，连续3 d血糖浓度均>11.1 mmol/L视为造模成功。

1.4 分组与给药

大鼠随机分为5组：正常对照组、模型组、山腊梅叶提取物低剂量、高剂量组及二甲双胍组，每15只，各组大鼠体质量、年龄差异无统计学意义。低、高剂量药物组大鼠分别灌胃给予乙醇提取物250 mg/kg和500 mg/kg，二甲双胍组灌胃给予大鼠二甲双胍100 mg/kg，正常组及模型组给予等体积生理盐水。正常组以正常饲料喂养，其他组以高脂高糖饲料喂养+腹腔注射小剂量STZ处理。

1.5 观察指标

1.5.1 全自动生化分析仪检测血清 胆固醇（TC），三酰甘油（TG）及低密脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量 给药8周结束时，大鼠禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物，从下腔静脉缺血，注入离心管（4℃），以3 000 r/min离心20 min后提取血清，用全自动生化分析仪测定血清TC、TG、LDL-C水平。

1.5.2 酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清胰岛素水平检测前先对样品进行低温离心，取血浆，根据试剂盒说明书进行检测。在反应孔中加人100 μL标准品或待测标本，在空白孔中加入等量稀释液，用37℃培养箱进行孵育，孵育后洗涤，最后加酶标抗体进行酶联免疫反应，反应终止后在酶标仪上进行检测。检测波长为450 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度值。

1.5.3 检测肝脏相关蛋白表达 大鼠取血后处死，小心取出完整肝脏，进行液氮预冻处理，并放到-80℃的冰箱中冷冻保存、待取用。使用蛋白免疫印迹法测定胰岛素抵抗最主要的通路PI3K、AKT信号传导通路中胰岛素受体底物（IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、葡萄糖转运体4（GLUT-4）4种相关蛋白质的表达。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 山腊梅叶乙醇提取对大鼠空腹血糖和糖化血红蛋白的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示造模成功；与模型组比较，山腊梅叶乙醇提取物低、高剂量组及二甲双胍组大鼠空腹血糖及糖化血红蛋白水平均明显降低，胰岛素水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血糖、糖化血红蛋白和胰岛素的测定结果对比

表1 各组大鼠血糖、糖化血红蛋白和胰岛素的测定结果对比

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别 空腹血糖（mmol/L） 糖化血红蛋白（%） INS（mU/L）正常对照组（n=15）模型组（n=15）二甲双胍组（n=15）低剂量组（n=15）高剂量组（n=15）5.64±0.72（14.76±1.94）a（6.86±0.85）c（8.04±1.06）c（6.48±0.93）c 5.91±1.12（17.56±3.59）a（7.57±1.52）c（10.02±2.96）b（8.43±2.56）c 91.36±19.79（21.25±5.02）a（52.58±11.35）c（38.42±7.82）c（49.38±9.16）c

2.2 山腊梅叶乙醇提取对大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的影响

与正常组比较，模型组糖尿病大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，山腊梅叶乙醇提取物低、高剂量组及二甲双胍组大鼠血清TC、TG及LDL-C水平均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的测定结果对比[（），mmol/L]

表2 各组大鼠血清TC、TG及LDL-C水平的测定结果对比[（），mmol/L]

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别 TC TG LDL-C正常对照组（n=15）模型组（n=15）二甲双胍组（n=15）低剂量组（n=15）高剂量组（n=15）8.14±1.91（16.18±2.97）a（9.26±1.84）c（12.07±3.31）b（10.68±2.18）c 5.42±0.85（9.82±1.65）a（7.57±1.52）b（8.28±2.06）b（7.39±1.68）c 1.93±0.34（10.41±1.95）a（5.56±1.22）c（7.95±1.58）c（4.69±0.83）c

2.3 实验大鼠肝脏IRS、PI3K、AKT、GLUT-4测定结果

与正常对照组相比，其他组IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表达皆降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，山腊梅叶乙醇提取物低、高剂量组及二甲双胍组大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4表达均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 实验大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4测定结果对比

表3 实验大鼠IRS、PI3K、AKT、GLUT-4测定结果对比

注：与模型组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别 IRS PI3K AKT GLUT-4正常对照组（n=15）模型组（n=15）二甲双胍组（n=15）低剂量组（n=15）高剂量组（n=15）（1.03±0.24）a 0.32±0.11（0.46±0.14）ab（0.55±0.16）a（0.62±0.21）ab（1.01±0.21）a 0.26±0.08（0.47±0.15）a（0.58±0.1）7ab（0.43±0.12）ab（1.01±0.21）a 0.36±0.13（0.79±0.34）a（0.61±0.21）ab（0.56±0.16）ab（1.00±0.20）a 0.25±0.06（0.68±0.24）ab（0.48±0.16）a（0.62±0.21）ab

3 讨论

目前，人们生活水平有了很大的提高，糖尿病临床发病率也呈逐年增长的趋势，且发病年龄更见向着年轻化发展，成为继肿瘤、心脑血管疾病后的第三大威胁人类健康的慢性疾病。胰岛素对体内血糖稳态的调节发挥着重要的作用。胰岛素与靶器官细胞膜表面的胰岛素受体结合，并通过细胞信号传导通路调节糖代谢相关基因的表达从而发挥调节代谢功能[12-14]。IRS-1、PI3K、Akt信号通路是胰岛素信号转导的主要途径。研究表明IRS-1在体内以磷酸化的形式被激活后与下游受体蛋白相互作用，并能够使其下游的PI3K活化，PI3K被激活后进一步活化Akt，Akt活化后能够进一步激活下游蛋白，从而促进细胞内能量代谢，增加体内葡萄糖消耗，从而抑制体内脂质的合成[15]。相反，该通路中任何一个因子或环节出现功能障碍或表达异常均可诱发胰岛素抵抗，出现糖尿病和高脂血症等多种疾病[16-18]。该次研究结果显示，山腊梅叶乙醇提取物能够上调IR3、PI3K、AKT水平，加速GLUT-4转运，促进其向细胞膜的移位与骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，继而达到降低血糖、维持糖代谢平衡的作用。

山腊梅即亮叶腊梅，在江西广泛分布，是畲族最常用的治疗糖尿病的药材。赣南山区称食凉茶，又称黄金茶。近年来，人们也逐渐加大了对山腊梅的开发力度，山蜡梅单品或以其为主要原料的方剂已加工成山蜡梅叶颗粒，山蜡梅清感茶、山蜡梅滴丸、脾胃舒等成品药。该研究结果显示，与模型组大鼠比较，山腊梅叶乙醇提取物低、高剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、血清TC，TG及LDL-C水平均改善，2 h餐后血清胰岛素和肝脏IRS-1、PI3K、Akt、GLUT4蛋白表达水平均明显升高，表明山腊梅叶乙醇提取物调节血糖平衡，促进胰岛素分泌的机制可能是通过上调胰岛素受体信号转导通路IRS-1、PI3K、Akt途径磷酸化水平蛋白表达，提高GLUT4蛋白的表达和跨膜转运，从而促进大鼠对葡萄糖的转运和利用，减少脂质的生成。