杞归八味口服液对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的防护作用*

傅若秋，李 斌，王显凤，张 琳，王林丽，陈剑鸿

（中国人民解放军陆军军医大学大坪医院药剂科，重庆400042）

神经退行性疾病是中老年人的常见疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、多发性硬化等[1]，发病原因较复杂，大多机制不明，其共同点为大脑和脊髓的神经元细胞发生病变，出现损伤，常用的治疗策略为对神经元细胞进行保护[2]。中药及中药单体在调节神经系统、保护神经细胞方面有独特作用，如半夏泻心汤、天麻钩藤饮、槲皮素、花青素等多种中药复方制剂或中药单体均可防护神经细胞免受损伤[3－6]。杞归八味口服液（曾用名益精灵口服液）为我院特色自制制剂，由何首乌、枸杞子、菟丝子、牛膝、当归、补骨脂、茯苓、陈皮8味中药组方，具有健脑安神、滋补肝肾功效，用于治疗失眠多梦、健忘、腰膝酸软、神疲乏力等症，疗效显著，已在临床使用近30年。其组方中所含甜菜碱、β蜕皮甾酮、异鼠李素等活性成分具有神经保护作用[7－9]。前期研究证实，其具有神经系统调节作用，可抗抑郁和增强小鼠的学习能力[10]。本研究中探讨了杞归八味口服液对鱼藤酮诱导PC12细胞损伤的防护作用及其作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；GS－15KGS型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；CKX41型光学倒置显微镜（日本Olympus公司）；165－8001型蛋白电泳仪、转膜槽、Chem I Doc型超高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio－Rad公司）；HR30－11A2型生物安全柜（青岛海尔股份有限公司）；C6型流式细胞仪（美国BD公司）；STNERGYH1型酶标仪（美国Agilent公司）。

试药：杞归八味口服液（医院制剂，批号为200413）；鱼藤酮（美国Selleck公司，批号为S2348）；PRIM培养基（美国Hyclone公司，批号为SH30809.01）；胎牛血清（天津康源生物技术有限公司，批号为20200408）；Western细胞裂解液（批号为P0013），BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号为P0009），胰酶消化液（批号为C02010），均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号为556547）；CCK－8试剂盒（美国MCE公司，批号为HY－K0301）；辣根酶标记山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为ZB2305）；预染蛋白Marker（美国Thermo公司，批号为26619型）；蛋白激酶B（AKT）抗体（批号为ab200195），磷酸化AKT（p－AKT）抗体（批号为ab192623），哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗 体（批 号 为ab2723），磷 酸 化mTOR（pmTOR）抗体（批号为ab137133），c－Jun氨基端蛋白激酶（JNK）抗体（批号为ab179461），磷酸化JNK（p－JNK）抗体（批号为ab124756），均购自美国Abcam公司；磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（美国CST公司，批号为21185）；聚腺苷二磷酸－核糖多聚酶（PARP）抗体（批号为13371－1－AP），cleaved－Caspase3（c－Caspase3）抗体（批号为19677），均购自武汉三鹰生物技术有限公司）。

细胞：鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞株（美国ATCC细胞库，批号为CRL－1721）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

PC12细胞用PRIM培养基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2条件下恒温培养箱中培养，隔天传代，取对数生长期细胞进行试验。

1.2.2 CCK－8试验检测

取对数生长期的PC12细胞，经胰酶消化后得细胞悬液，按（5 000个细胞，90 μL）／孔接种于96孔板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，加入受试药物10 μL。药物分组：1)杞归1组、2组、3组、4组、5组（以杞归八味口服液原液浓度为100%计，作用浓度分别为0.1%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%），药物作用24 h；2)鱼藤酮1组、2组、3组、4组、5组（相当于鱼藤酮0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 μmol／L），药物作用24 h；3)杞归八味口服液联用鱼藤酮：空白对照组（水）、鱼藤酮4组，以及杞归1，2，3，4，5（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%）＋鱼藤酮4组，先给予杞归八味口服液预处理2 h，再给予鱼藤酮作用24 h。药物处理结束后，每孔加入CCK－8试剂10 μL，置培养箱中孵育1 h，用酶标仪于450 nm波长处检测吸光度，并计算细胞存活率。

1.2.3 流式细胞仪检测

取对数生长期的PC12细胞悬液，按2.0×105个／孔接种于6孔板中，每孔培养基体积2 mL，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，给予杞归八味口服液及鱼藤酮药液作用24 h。胰酶消化后收集于15 mL离心管中，800 r／min离心5 min，弃上清液，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混悬细胞，800 r／min离心5 min，弃上清液，加入凋亡检测染色液（含Annexin V－FITC染液2 μL，PI染液5 μL，Binding buffer 100 μL），混匀，室温避光染色15 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算凋亡率。

1.2.4 蛋白质印迹（Western blotting）法检测

取对数生长期的PC12细胞悬液，按2.0×106个／孔接种于100 mm培养皿中，每孔培养基10 mL，于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，给予杞归八味口服液预处理2 h，然后给予鱼藤酮作用24 h。提取全细胞蛋白，用BCA法测定蛋白含量。蛋白液中加入5×loading buffer混匀，于98℃加热使蛋白变性。变性后的蛋白样品用聚丙烯凝胶电泳进行分离，分离后的蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗孵育过夜。次日回收一抗，TBST漂洗后于室温下孵育二抗1 h。TBST漂洗后加入发光底物，用凝胶成像系统进行曝光。WB条带用Image J 1.37C软件测量其灰度值，以目的蛋白与内参蛋白的灰度比值作为蛋白表达水平。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对PC12细胞存活率的影响

与空白对照组比较，杞归3组、4组、5组的细胞存活率均显著升高，且呈量效依赖趋势（P＜0.05）；鱼藤酮1组、2组、3组、4组、5组的细胞存活率均显著降低，且呈量效依赖趋势（P＜0.01）。详见表1。

表1 杞归八味口服液及鱼藤酮对PC12细胞存活率的影响Tab.1 Effects of Qigui Bawei Oral Liquid and rotenone on the survival rate of PC12 cells

2.2 对鱼藤酮降低PC12细胞存活率的影响

与鱼藤酮4组比较，杞归3，4，5＋鱼藤酮4组的细胞存活率均显著升高，且呈量效依赖趋势（P＜0.01）。可见，联用杞归八味口服液可明显减弱鱼藤酮导致的细胞存活率下降。详见表2。

表2 杞归八味口服液对鱼藤酮降低PC12细胞存活率的影响Tab.2 Effect of Qigui Bawei Oral Liquid on rotenone reducing the survival rate of PC12 cells

2.3 对鱼藤酮诱导细胞凋亡的影响

与空白对照组比较，鱼藤酮组细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与鱼藤酮组比较，杞归4＋鱼藤酮4组细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。可见，鱼藤酮能明显诱导PC12细胞凋亡，但杞归八味口服液能阻止鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡。详见图1和表3。

图1 流式细胞仪检测PC12细胞凋亡情况A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.1 The apoptosis of PC12 cells detected by flow cytometry

2.4 对鱼藤酮激活凋亡相关蛋白和AKT／mTOR及JNK信号通路的影响

与空白对照组比较，鱼藤酮4组PARP蛋白表达水平显著降低，c－Caspase3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与鱼藤酮组比较，杞归4＋鱼藤酮4组PARP蛋白表达水平显著升高，c－Caspase3蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。可见，鱼藤酮能明显激活凋亡相关蛋白，但联用杞归八味口服液可明显减弱鱼藤酮对凋亡蛋白的激活。与空白对照组比较，鱼藤酮4组p－AKT和p－mTOR蛋白表达水平均显著降低，p－JNK蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与鱼藤酮4组比较，杞归4＋鱼藤酮4组p－AKT和p－mTOR蛋白表达水平均显著升高，p－JNK蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。可见，鱼藤酮抑制了AKT／mTOR信号通路，并激活了JNK信号，但联用杞归八味口服液可明显减弱鱼藤酮对AKT／mTOR及JNK信号通路的影响。详见表3和图2。

表3 细胞凋亡率及蛋白表达水平比较(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

表3 细胞凋亡率及蛋白表达水平比较(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与鱼藤酮4组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with those in the rotenone group 4，△P＜0.05，△△P＜0.01.

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图2 Western blotting法检测PC12细胞的蛋白表达水平A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.2 The protein expression of PC12 cells detected by Western blotting

3 讨论

PC12细胞是一种大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞株，具有神经内分泌细胞的普遍特征，且可传代，广泛用于神经生理及药理学研究[11]。鱼藤酮是一种从豆科鱼藤属植物中提取的异黄酮化合物，在农业上作为杀虫剂被广泛使用，因具有较强的神经毒性，也被作为神经细胞损伤的造模药物广泛应用[12]。在构建鱼藤酮损伤的PC12细胞模型中，不同研究者所用的鱼藤酮剂量及作用时间不一致，作用浓度为0.5～10 μmol／L，作用时间为4～24 h[13－15]，这可能与各实验室所用培养条件、细胞状态及细胞对药物的敏感度不一致有关。通过前期试验，选择鱼藤酮浓度为4 μmol／L，作用时间为24 h，成功构建了PC12细胞损伤模型，细胞凋亡率可达33%，细胞活性下降约40%。

通过预试验发现，0.5%及1.0%浓度的杞归八味口服液可增强PC12细胞的活性，但2.0%浓度的杞归八味口服液反而使PC12细胞活性降低。进一步考察杞归八味口服液在0.1%～0.8%浓度范围内对PC12细胞活性的影响，结果发现0.4%～0.8%浓度的杞归八味口服液可增强PC12细胞的活性，可明显减弱鱼藤酮导致的PC12细胞活性下降，且0.6%浓度时作用即达到最大，故选择0.6%浓度作为后续药理机制研究的作用浓度。

细胞凋亡是细胞死亡的一种常见方式，也是鱼藤酮损伤PC12细胞的主要原因[16]。PARP蛋白可特异性地识别DNA断裂末端并结合，是一种重要的DNA修复酶，当凋亡发生时，可被上游的Caspase－3剪切降解而丧失DNA修复功能[17]。Caspase－3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，通过自身剪切激活后，再催化PARP发生降解[18]。因此，Caspase－3剪切激活及PARP发生降解被认为是凋亡发生的标志[19]。本试验结果证实，鱼藤酮诱导PC12细胞发生凋亡，Wester blotting试验结果证实，鱼藤酮可导致PARP降解（PARP蛋白表达水平降低）和Caspase－3剪切激活（c－Caspase3蛋白表达水平升高）。同时，杞归八味口服液能减弱鱼藤酮诱导的细胞凋亡，并减弱鱼藤酮导致的PARP蛋白表达水平的降低及c－Caspase3蛋白表达水平的升高，表明杞归八味口服液减轻了鱼藤酮对PC12细胞的损伤作用。

常见的有PI3K／AKT／mTOR，MAPK（JNK／ERK／P38），STAT3，Wnt／β－catenin，NF－κB等[20]信号通路蛋白参与细胞凋亡的调控。而AKT／mTOR通路的抑制及JNK信号激活是鱼藤酮导致神经细胞损伤的常见机制[21－22]。AKT是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，作用广泛，与细胞内许多信号通路有关；mTRO是AKT的下游分子，属于一种不典型的丝氨酸／酪氨酸蛋白激酶。AKT／mTOR信号通路对维持细胞存活、促进细胞增殖和生长非常重要。在中枢神经诱导损伤的研究中发现，抑制AKT／mTOR通路可加重神经细胞的损伤作用，而激活该通路则可对神经细胞起保护作用[23]。JNK是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，属于MAPK家族的一员，在细胞凋亡的调控中发挥重要作用，JNK磷酸化激活后能介导多种细胞（如神经、心肌、肝、肿瘤等）的凋亡反应[24]。本试验结果显示，鱼藤酮可抑制AKT／mTOR信号通路，并激活JNK信号；同时发现杞归八味口服液可减弱鱼藤酮对AKT／mTOR通路的抑制及对JNK的激活作用，表明杞归八味口服液通过AKT／mTOR及JNK途径保护了PC12细胞。

综上所述，杞归八味口服液可减轻鱼藤酮对PC12细胞的损伤作用，可能与其减弱了鱼藤酮对AKT／mTOR及JNK信号通路的影响有关。由于杞归八味口服液成分复杂，其发挥神经保护作用的具体物质基础（有效单体化合物）还有待进一步研究。