不同模式表面等离子体共振与其他分析检测技术联用

赵 欣， 王瑞敏， 康 青*， 汪鹏程， 周飞艨*

(表面分析与化学生物学研究院，济南大学，山东济南 250022)

1 引言

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是发生在金属与介质界面的一种光学现象。当一束光以大于临界角从光密介质传播到光疏介质时，在界面的全反射使本应折射的光束返回光密介质。而实际上有部分入射光会渗透到光疏介质中，平行于界面传播(消逝波)。消逝波在光疏介质中传播一段距离会再回到光密介质，而当消逝波的频率与金属表面振荡的自由电子(即等离子)频率一致时，等离子将吸收入射光的大部分能量发生共振，使反射光能量减少直至完全消失，这时的入射角称为共振角(SPR角)。SPR角随金属表面的折射率变化而产生变化。因为在表面的分子吸附能导致质量变化而引起折射率的变化，所以共振角的移动、反射光强度的变化和调制的相位均可用来获得分子吸附过程和分子间结合的定量信息。由于所有物质均有折射率，因此SPR技术具有免标记和高灵敏度等优点[1]。近年来SPR技术得到了迅猛的发展，SPR与其他检测技术的联用可结合多种技术的优势，中科院长春应用化学研究所的牛利教授课题组、北京大学的刘虎威教授课题组、南京大学的王伟教授课题组等已分别对SPR-电化学[2]、SPR-质谱[3]、SPR显微镜成像[4]技术特征进行了详尽的概括和总结。但据我们所知，尚未有比较SPR三种模式(常规SPR，成像SPR，SPR显微镜技术)的同异性和应用体系的综述。鉴于赵藻藩先生在分析化学尤其是电分析化学方面的卓越成就，作为纪念论文之一的本文着重在三种模式的分析技术特性(Analytical Figures of Merit)和其与多通道流通体系，和以电化学为代表的其他检测技术的联用方面的工作进行介绍。

图1A所示的常用SPR装置是Kretschman结构。当样品流经芯片表面时，样品中的待测物会与芯片表面的预先固定的配体发生特异性结合，使传感芯片表面折射率随时间变化，从而产生SPR传感谱图(Sensorgram)。通过对传感谱图的模拟和分析准确得到分子结合亲和力和动力学速率常数的数据[5]。由于免标记，受配体的结构及其之间的结合不受影响，SPR[6]和等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC[7])已成为测量分子间亲和力等热力学参数的最佳手段，且SPR还能获得动力学速率常数。

鉴于常规SPR模式无法进行高通量分析，蛋白质/核苷酸阵列和SPR技术结合催生了SPR成像技术(Surface Plasmon Resonance imaging,SPRi)。与常规SPR必须先后分析多种待测物不同的是：SPRi可同时记录微阵列芯片上每个阵列点产生的传感谱图[5,8]，因此可以对复杂样品中的多个待测物予以高通量分析，大大节省了分析时间和样品量[9]。图1B所示的SPRi模式中，通过棱镜放大的入射光束覆盖芯片上预先打印的各阵列点，反射光被CCD相机捕获而成像[5]。由于常规SPR可以在无需移动光学部件的前提下通过对共振角的移动和改变反射光强度[5,10]得到传感谱图，因此噪音小，信噪比好于SPRi。尤其通过相位调制[11]和局域化SPR(Localized SPR)[12]，灵敏度还可提升至少一个数量级。

SPRi使用的三角棱镜会将扩大的光斑扭曲为椭圆型，且SPRi成像仪空间分辨率(100 μm[13])不高，因此SPR显微镜成像(Surface Plasmon Resonance Microscopy,SPRM)技术应运而生[14,15]。如图1C所示，SPR与倒置显微镜相结合，大大提高了分辨率[4]。同时利用倒置显微镜自带的光源获得SPRM感应区的明场图像，SPR图像的每个像素处均可产生对应的传感谱图，空间分辨率高达～1 μm。因此可用于可视化研究，如细菌、细胞、病毒、囊泡以及纳米粒子等[4]。特别是对细胞膜蛋白分子与配体或药物的相互作用的研究，使常规SPR以及SPRi只能望其项背[4]。但SPRM作为一种新技术，还有很多基础问题和现象需要研究，与常规SPR以及SPRi相比，在通量和相互作用动力学研究数据的准确性上尚待完善。

图1 SPR的三种模式。(A)常规SPR[1],示意图中的三角棱镜常以半圆棱镜取代，且包括对共振角的移动和反射光强度变化或相位调制予以锁相放大等检测方法；(B)SPRi[5]；(C)SPRM。(D)SK-BR3细胞的SPRM图像[16]。(E)SK-BR3细胞的典型SPR传感谱图[16]。Fig.1 The three modes of SPR.(A) A conventional SPR system[1],the triangular prism shown in this representative diagram is commonly replaced by a hemispherical prism and the detection mechanism includes the measurements of the SPR resonance angle and the intensity of the reflected light near the angle and monitoring the phase shift of modulated light by a lock-in amplifier;(B) An SPR imaging system[5];(C) SPR microscopy.(D) A typical SPR image of SK-BR3 cells [16].(E) The SPR sensorgrams of SK-BR3 cells [16].

表1对比了三种SPR模式的技术特征。三种SPR模式的测量对象和应用范围不尽相同，因此在生物分析、生物物理和化学生物学、药物研发中扮演不同的角色，可说是取长补短，相得益彰。因此三种模式均已有商品化的仪器。

表1 SPR、SPRi、SPRM模式的技术特征和应用对象比较[17-20]Table 1 Comparison of the figures of merit and applications among SPR,SPRi and SPRM[17-20]

(续表1)

2 SPR联用技术

近年来，常规SPR传感己趋于成熟，因此SPR技术与其他技术联用成为研究热点。联用技术可弥补SPR不能鉴定分子结构和消除表面存在一些干扰等的不足，并能进一步提高检测的灵敏度和选择性。

2.1 与微流控和多种流动注射系统的联用

微通道流通系统是SPR生物传感测量的一个关键部分，其控制精度不仅与获取的数据的可靠性相关，也决定了耗样量和传质速率大小等因素。细窄的SPR流通池通道一般通过微加工实现，样品的递送可通过微流控装置或流动注射分析系统控制。早期基于常规SPR模式的流通池为双通道(其中之一作为参比通道用于扣除背景信号)，为获得多个传感谱图需要将不同浓度的待测物先后注入配体覆盖的分析通道中，且每一次分析后必须对传感芯片予以再生。近年来开发出的多通道系统不仅提高了通量，改变了传统的分析流程，还可以灵活地控制不同的通道的开启与关闭而进行双通道SPR无法实现的实验。如本课题组通过有序地关闭流通池的五个通道，只需要注射一次配体溶液即可在五通道SPR仪中的四个流通通道中固定不同密度的配体(图2A)。然后一次注射待测分子即可同时得到扣除第五通道背景后的四条不同传感曲线(图2B)。该方法流程简单，避免了芯片再生的筛选和优化，从而降低了样品和芯片的消耗[21]。我们还开发了一种双阀进样流通体系，提高了生物识别分子固定量和免再生SPR检测的灵敏度[26]。该方法可以实现一种或多种样品以串联或并联方式进样。这种交替注射模式不仅节省进样时间，还能高效简便地固定配体，防止待测物的解离。这种检测方法同样避免了常规方法对生物复合物重复解离而再生芯片的步骤，并将SPR拓宽到了由于芯片再生而导致蛋白二级结构无法恢复的体系的研究中。

微流控技术可以组建更多的通道、进样接口、平行排布相同的结构单元[27 - 30]，因此微流控技术与SPR联用可以更大地提高检测通量[28,30,31]和减少样品消耗。例如日本产业技术综合研究所的Kurita课题组采用微流控多通道SPR图像识别技术对细胞状态进行了评估[22]。他们用聚二甲硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)原料制备了流通池，在SPR芯片上修饰五种不同结构的半胱氨酸衍生物。获取了正常细胞和4种癌细胞的培养基中细胞代谢物与不同的半胱氨酸衍生物相互作用产生SPR传感响应图样(图2C、2D)。该方法所设计的多通道微流控体系消耗样品少(～25 μL)且测量快捷(10 min)，所获得的信息全面且不依赖特定的生物标记物。这种细胞无损伤的图像识别方法有望成为表征细胞的通用工具。此外美国斯坦福大学的Demirci课题组开发了一种便携式、免标记的病原体检测平台[32]。该平台整合了微流控和SPR技术，显示了对细菌病原体(如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)现场即时定量检测的能力，弥补了传统的病原体检测法(如酶联免疫法和聚合酶链反应)耗时长的不足，有望推广到其他病原体检测或用于临床诊断中。另外，微流控连续进样通过PDMS模具(图2E)一次性制备微阵列芯片可用于G蛋白及对应抗体的SPRi检测[23]。该技术可以在芯片表面来回进样孵育，增加了固定密度、减少了样品消耗、缩小了传统点样针打点造成的点间差异，提高了检测通量。近期96通道的微流控进样器配合96点的微阵列芯片，可以自动检测9216(96×96)次分子间的相互作用[33]。类似的微阵列芯片也被应用于新冠病毒抗体的检测。通过注射不同类型的免疫球蛋白抗体(anti-IgA，anti-IgG和anti-IgM),新冠病人血清在微阵列芯片上会产生不同的响应信号(图2F),可以对病人血清中各类免疫球蛋白进行定量分析[24]。Rinat-Pfizer公司推出了一种运用水平和垂直双向微流控装置制备微阵列芯片的方法(图2G)[25]。在水平方向注射待测物，垂直方向注射配体。在不同通道不同位点实现了不同待测物活化固定，并以此分析了36种IgG与15种生物肽的相互作用[25]。

图2 (A)通过自下而上先后关闭通道来固定不同量的前列腺特异性抗原(PSA)抗体(弯曲箭头表示溶液流动方向；褐点为控制通道关闭和打开的端口[21])。(B)往预先固定了0.078、0.148、0.268和0.458 ng·mm-2 牛血清蛋白(BSA)的通道中单次注射300 nmol·L-1 BSA抗体[21]。(C)固定有半胱氨酸衍生物的多通道SPR芯片的照片[22]。(D) 由半胱氨酸衍生物和不同组分的细胞培养基之间的交叉反应产生的SPR响应信号[22]。(E)聚二甲硅氧烷微流控打印模型。每个点孔有两个微孔，通过微流控连续注射控制待测物的固定[23]。(F)SPRi微阵列检测血清中新冠病毒抗体含量。通过不同点对应的血清与免疫球蛋白抗体产生的信号，定量各类免疫球蛋白含量[24]。(G)双向微流控制备微阵列芯片示意图[25]。Fig.2 (A) Immobilization of bovine serum albumin onto different fluidic channels via sequential closures of the channels from downstream up.The direction of the solution flow is shown by the curved arrows and the ports for channel closure and opening are denoted by the brown dots [21].(B) A single injection of 300 nmol·L-1 anti-BSA antibody into channels pre-immobilized with 0.078,0.148,0.268,and 0.458 ng·mm-2 BSA[21].(C) A photograph of the cysteine derivative-covered multichannel SPR chip for pattern-recognition-based cell sensing [22].(D) SPR response patterns resulting from cross-reactive interactions between cysteine derivatives and cell culture media with different components[22].(E) A polydimethylsiloxane(PDMS) microfluidic printer[23].(F) Anti-SARS-CoV-2 immune globulins SPRi assay.The process of spotting sera samples to a RBD-coupled surface and its resultant SPRi reflectivity image [24].(G) Schematics of the dual-directional microfluidic method as an array biosensor[25].

电化学技术可以研究物质伴随电子转移在表面的吸脱附或是表面吸附物的氧化还原过程[2]。电分析虽然可以灵敏地测量单分子或亚单分子层吸附物，但伏安曲线易受充电电流和复杂体系中多峰重叠现象等因素的干扰。虽然各种光谱电化学方法可以提供很多结构方面的信息，但对吸/脱附物的定量往往求助于如石英晶体微天平(QCM)等能测量质量变化的技术。如前所述，SPR测得的折射率的变化其实与质量变化定量相关[2,6]。因此，SPR也是一个质量检测器，且灵敏度高于QCM。比如基于10 MHz 的晶振的灵敏度为5 ng·cm-2[36],而SPR的灵敏度高达0.01～0.1 ng·cm-2。因此电化学SPR(EC-SPR)已有较长的研究和应用历史。本文主要针对电化学与三种SPR模式联用的案例和数据解读需要考虑的因素进行探讨。

EC-SPR技术已发展到多个领域，如痕量检测[37,38]、表面吸脫附过程[39]、电聚合反应过程[40 - 42]、电极反应动力学常数的测定[43]、生物分子间相互作用[44]以及生物传感[45,46]。循环伏安法(Cyclic Voltammetry,CV)与SPR技术联用可灵敏地测量氧化还原过程中吸附物的质量，甚至是表面固定的生物分子构型的细微变化。和QCM测得的质量变化必须考虑吸附物的粘弹性和传感器的灵敏度分布[36]一样，EC-SPR 需要考虑测得的共振角变化(Δq)由于吸附层厚度(Δd)和电荷密度(Δs)的变化产生的信号：

Δq=c1Δd+c2Δn+c3Δs

(1)

其中，Δn为电极表面折射率变化，c1、c2和c3为系数。

在循环伏安过程中电极表面电荷密度s随扫速v变化：

s=vCd[t-RsCd+RsCde-t/RsCd]/A

(2)

公式(2)中，Rs是溶液电阻，Cd是双电层电容，A是电极面积。

因此循环伏安过程中双电层的充电电流不断变化会一直改变电极表面电荷密度，使得SPR信号的解析变得复杂。我们发现电位阶跃法(Potential-step Chronoamperometry,PSC)比循环伏安法更适合与SPR联用以精确测量电沉积薄膜的厚度[34]。

在PSC法中：

s=ECd[1 -e-t/RsCd]/A

(3)

根据估算，充电电流会在极短的时间内(少于1 ms)达到稳定值(ECd/A)，大大小于电沉积和电聚合等过程需要的成核时间。我们用PSC-SPR观测到了成核步骤后二维扩展成单层铜膜，以及三维生长成聚苯胺的过程，而这一过程在仅用循环伏安或用循环伏安-SPR是不易观察到的。当双电层充电电流减小后SPR测得的电聚合薄膜的厚度与原子力显微镜(AFM)测的十分吻合(图3A、3B)。另外重庆大学的胡卫华课题组采用PSC-SPR技术首次对电化学介导表面引发的原子转移自由基聚合过程进行了原位现场检测[35]。图3C为他们所用装置图，将含有CuBr2和联吡啶、甲基丙烯酸缩水甘油酯和KCl溶液流过SPR检测及参比通道，通过PSC法调控活化剂的比率来引发、控制、终止金膜表面聚合反应过程(图3D)。

图3 (A)1.0 mmol·L-1苯胺溶液中电位从0.0 V阶跃至0.7 V的q -t图(插图是在1.0 mmol·L-1苯胺+100 mmol·L-1 HClO4(黑色曲线)和100 mmol·L-1 HClO4(蓝色曲线)溶液中用电位阶跃从0.0至0.7 V获得的计时电流图[34]。(B)膜形成后Au/聚苯胺边界的AFM图像(底部的高度图对应于AFM图像中白色线条部分[34])。(C)用于原位电化学介导表面引发的原子转移自由基聚合过程的EC-SPR设置[35]。(D)电位从开路电位步进至0(a)、-0.03(b)、-0.06(c)、-0.10(d)和-0.15 V(e)时的SPR响应(箭头表示施加电位的时刻[35])。Fig.3 (A) q -t diagram upon a potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline(Inset is the chronoamperograms obtained from the potential step from 0.0 to 0.7 V in 1.0 mmol·L-1 aniline +100 mmol·L-1 HClO4(black curve) and in 100 mmol·L-1 HClO4(blue curve)[34]).(B) An AFM image of the Au/PAni boundary after the film formation(The cross-sectional contour at the bottom corresponds to the white line in the AFM image[34]).(C) Illustration of the EC-SPR Setup for in-situ electrochemically mediated surface-initiated atom transfer radical polymerization(eSI-ATRP) investigation [35].(D) Simultaneous SPR response for stepping the potential of a gold chip from the open-circuit potential to 0(a),-0.03(b),-0.06(c),-0.10(d),and -0.15 V(e)(The arrow indicates the moment when the potential was applied[35]).

早期电化学和SPRi的联用主要是利用电化学方法制作阵列[49]，或利用施加的电场加快表面吸附过程[50]，但由于SPRi的局部成像分辨率不高，而灵敏度又低于常规SPR，因此EC-SPRi 此后并没有得到更多的关注。近年来SPRM解决了SPRi成像不清晰和灵敏度的问题，且成像速度明显快于扫描探针显微技术(SPM，当然对比于SPM纳米区域的成像SPRM还是难以媲美)，因此SPRM和电化学结合的EC-SPRM具有独特的应用前景。与EC-SPR不同的是：EC-SPRM一方面可获得电极或金属膜不同部位的电化学过程的精细图谱，另一方面又可以通过施加的电位或电流增强SPRM图像的对比度。但EC-SPRM联用技术也受双电层充电电流[51]和表面过程[52]的影响。美国亚利桑那州立大学的陶农建教授课题组将PSC与SPRM技术联用，能够在毫微秒响应时间内检测微电极上的细胞色素c的氧化还原反应和相对应的构象变化(图4A)[47]。研究结果表明电子转移过程中的构象门控发生在从微秒到毫秒的较宽时间范围内(图4B、4C)。另外，同一课题组还对单根金纳米线(AuNW)的表面电化学反应进行了等离子成像研究[48]。若AuNW上发生电化学反应，其SPR散射强度也会随之发生变化，从而提供了单根AuNW的电化学信息。该设计消除了传感层的干扰，同时保留了清晰的SPR响应，首次获得了单根AuNW的循环伏安图。他们还研究了单根AuNW上不同位置的局域电化学反应的差别(图4E、4G)。

图4 (A)具有超快光学检测功能和小型化微电极的等离子体电化学显微镜(P-ECM)装置图[47]。在10 μs内的氧化(B)和还原(C)过程中的P-ECM拟合数据。氧化过程中电极电位从-0.3 V阶跃至+0.3 V；还原过程中电极电位从+0.3 V阶跃至-0.3 V [47]。(D)等离子体电化学显微镜(P-ECM)实验装置图[48]。(E) 单根10 μm 金纳米线(AuNW)的明场光学图像[48]。(F)该AuNW在-0.2 V下对应的P-ECM图像。黑色虚线表示AuNW的位置[48]。(G)位于AuNW上标为1,2两个位点的等离子体CV 曲线(蓝线和红线)和多根AuNW的常规CV曲线(黑线)，电解质为0.2 mol·L-1 NaOH，电位循环速率为0.2 V·s-1[48]。Fig.4 (A) Optical setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM) with ultrafast optical detection and miniaturized microelectrodes[47].P-ECM fitting data during oxidation(B) and reduction(C) over 10 μs.The electrode potential was stepped to +0.3 V from -0.3 V during oxidation,to -0.3 V from +0.3 V during reduction[47].(D) Experimental setup of plasmonics-based electrochemical microscopy(P-ECM).(E) Optical transmission image of a 10 μm AuNW[48].(F) A P-ECM image of the AuNW at -0.2 V.The black dashed line marks the location of the AuNW[48].(G) Plasmonic CVs from two locations on the AuNW(blue and red curves) and the conventional CV over a large ensemble of AuNW(black curve,and see also the inset).The electrolyte is 0.2 mol·L-1 NaOH,and the potential cycling rate is 0.2 V·s-1[48].

交流阻抗法 (Electrochemical Impedance Spectroscopy,EIS)[53]缺乏空间分辨率，一定程度上限制了其用于电化学过程的研究。陶农建教授课题组将电化学阻抗与SPRM结合成为电化学阻抗等离子体成像技术(Plasmonic Imaging of Electrochemical Impedance,P-EIM)，用于研究电化学反应[54]、分子结合动力学[55]、动态检测单细胞的凋亡和电穿孔过程中[56]。P-EIM的检测利用金膜表面SPR效应对表面电荷密度的高灵敏性，通过施加交流电测量相应的SPR信号，并将直流和交流组件分别转换为SPR和电化学阻抗显微(Electrochemical Impedance Microscopy,EIM)图像[57]。该SPR图像对传感表面质量变化敏感，可测量细胞的质量分布和动力学，EIM图像可提供细胞阻抗或电化学反应的有关信息[56,57]。例如运用P-EIM技术在亚细胞水平上对单个神经元动作电位的启动和传播进行成像[58]。此技术所用的光学器件与传统的膜片钳和荧光显微镜兼容，从而可以使用多种技术研究同一样品。因此该技术将有助于研究各种不同细胞中的电生理行为。

2.3 与其他技术联用

由于SPR流通池可以和很便捷地与各种流动体系结合，所以SPR已与高效液相色谱[59]、毛细管电泳[60]、各种质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization和Electrospray Ionization)[61,62]等联用。与QCM联用保留了SPR的对质量变化的灵敏性，同时利用QCM技术提供薄膜厚度及粘弹性结构等信息[63,64]。另外SPR和扫描电化学显微镜(Scanning Electrochemical Microscopy,SECM)[65]联用可以研究电化学诱导的表面局部反应。与荧光光谱[66,67]、红外光谱[68]、椭圆偏振[69]等光学技术联用也可以进一步提高检测的灵敏度和分辨率，以获取吸附物的结构信息。

3 结论与展望

本文比较了三种SPR模式的分析技术特性、应用范围、各种流动体系以及以电化学方法为代表的多种分析技术的联用。基于常规模式的SPR商品化后经过长达近40年的应用和芯片开发，已成为免标记研究分子间相互作用和药物研发等方面不可或缺的一个分析技术，日臻成熟的SPRi则在高通量检测和筛选以及组学研究方面锋芒毕露，异军突起的SPRM有望在针对单细胞膜蛋白为靶点的药物研发、细胞器的相关生物功能和活动的研究、单个纳米颗粒的结构研究等方面发挥其独特的作用。若要使SPRM的技术优势发挥得淋漓尽致，尚需进一步对SPRM观察的一些微纳尺寸的界面和区域的现象进行深入地基础研究。至于SPR的在线联用和原位观察也好，离线使用也罢，只要是两种和多种技术得当地应用在一个体系的研究中，往往能提炼出单一技术无法获取的信息。而要做到和这三种SPR模式的珠联璧合，就一定要了解乃至排除影响SPR信号变化的诸多因素，这些因素包括吸附分子的质量和极化性(两者均影响折射率)、吸附膜厚度、表面电荷、固/液界面和溶液温度、机械振动对光学系统的干扰等。一方面，其他技术既可提升SPR的技术特性和拓宽SPR技术应用范围；另一方面，SPR又可为其他技术提供一个实时、灵敏、免标记的检测手段。

随着科技的快速发展，相信这三种SPR模式的性能将继续提高，与其他检测技术的联用也会更加多样化。在人类还在继续与各种病原体及其变种顽强斗争的今天，能快速筛选各种疫苗、抗体、药物的技术将备受青睐；同时，开发能满足实时现场临床检测需求的微型化便携式仪器的努力还在继续，SPR在这两个方面都具有其独特的优势和潜力。