实时荧光PCR 检测在支原体肺炎诊断中的应用价值

孙振宏，王茵娜，黄慰慰

泉州市妇幼保健院儿童医院 （福建泉州 362000）

支原体是临床中常见的病原菌，通过呼吸道传播，具有较强的传染性及反复性。支原体肺炎患儿会出现发热、咳嗽等症状，且白细胞计数显著增高，若不能及时接受治疗，将会引发皮炎及中耳炎等病症，严重时甚至还会并发心肌炎或脑膜炎，对患儿的身心健康造成影响[1]。临床对于支原体肺炎的诊断多采用间接免疫荧光法检测呼吸道病原体谱抗体IgM，该方法操作简单，检出率较高，但诊断灵敏度、特异度较低，加之患儿发病早期缺乏特异性症状，易出现误诊、漏诊[2]。近年来，随着临床对分子生物学的研究不断深入，PCR 检测技术的应用越来越广泛。有研究显示，实时荧光PCR 检测的灵敏度、特异度均较高[3]。本研究探讨实时荧光PCR 检测在支原体肺炎诊断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年2月至2019年11月我院收治的90例支原体肺炎患儿，男42例，女48例；年龄0.5～7.0岁，平均（3.54±0.14）岁；病程7～44 d，平均（27.24±2.36）d。本研究经医院医学伦理委员会批准纳入标准：存在发热、呼吸急促；胸片出现异常改变；存在管状呼吸音；血清支原体肺炎IgM ≥1∶160；患儿家属签署知情同意书同意参与本研究。排除标准：患有先天性心脏病的患儿；脏器功能存在障碍的患儿；临床资料不完整的患儿；患有严重精神疾病的患儿。

1.2 方法

患儿入院后均完善有关检查，采集血清标本进行间接免疫荧光法检测呼吸道病原体谱抗体IgM，采集咽拭子进行实时荧光PCR 检测。（1）间接免疫荧光法检测：检测原理为，将稀释的患者血清与包被有检测基质的载片温育，若样本为阳性，特异性IgM 抗体与相应抗原结合，第2次温育时，结合的抗体与荧光素标记的抗人免疫球蛋白抗体反应，此时可在荧光显微镜下观察到特异性的荧光模型；检测步骤包括准备、加样、温育、冲洗、加样、温育、冲洗、封片，上述操作完毕后在显微镜下观察荧光模型；结果判读时，观察组织器官和感染的细胞采用20×物镜，观察细胞基质采用40×物镜，激发滤镜450～490 nm，分光镜510 nm，阻挡滤镜515 nm，光源100 W 汞灯，显微镜为欧蒙LED（EUROStar Bluelight，购置于上海兆仪光电科技有限公司）。（2）实时荧光PCR 检测：将采集的咽拭子标本与0.9%氯化钠注射液混合，12 000 r/min 离心5 min，去上清，沉淀中加入50 μl DNA提取液充分混匀，100 ℃恒温处理（10±1） min，12 000 r/min离心5 min，备用；提取DNA 后使用荧光PCR 进行定量检测，仪器选择ABI7500型实时荧光定量PCR 仪（苏州贝瑞仪器有限公司），试剂盒选择中山大学达安基因股份有限公司生产的肺炎支原体核酸定量检测试剂，严格按照说明书进行操作。

1.3 观察指标

比较免疫荧光法和实时荧光PCR 检测的检出率，并绘制ROC 曲线，分析两种方法单独及联合检测的诊断效能。

1.4 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，绘制ROC 曲线，分析诊断效能，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种方法的检出率比较

实时荧光PCR 检测的检出率高于间接免疫荧光法检测，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两种方法的检出率比较（90例）

2.2 两种方法单独及联合检测的诊断效能

ROC 曲线结果表明，联合检测的诊断灵敏度、特异度均高于两种方法单独检测，差异有统计学意义（P<0.05），见表2和图1。

表2 两种方法单独及联合检测的诊断效能

图1 不同检测方法在小儿支原体肺炎中的诊断ROC 曲线

3 讨论

支原体肺炎是一种经呼吸道传播的疾病，临床表现无特异性，极易出现漏诊、误诊的状况，很多患儿不能得到及时治疗，导致病情逐渐恶化，严重影响患儿的身心健康及生命质量[4]。该病患儿通过X 线片检查多发现肺部纹理明显增多，需采集血清、痰或咽拭子进行实验室检测，检测方法多以间接免疫荧光法测定为主，该方法可直接对病原体抗体进行检测，具有操作方便、速度快等特点，但其诊断灵敏度、特异度较低，极易出现假阳性，且仅适用于患儿体内存在抗体的情况，局限性较大，性价比较低[5]。

随着我国医疗诊断技术的不断进步，临床发现实时荧光PCR 检测对支原体肺炎的诊断准确性较高。实时荧光PCR 检测是一种新兴的体外核酸扩增技术，可同时扩增多个标本，直接反映患儿的感染情况[6]；该方法可通过探针实时监测扩增时的荧光信号，不必进行配胶、电泳等操作，可进一步缩短检测时间，同时还能提高诊断准确性[7]；加之该方法的诊断灵敏度、特异度较高，对传统培养技术的依赖性较低，更利于在临床推广应用；但该方法对样本的采集和操作环境要求较高，若样本的处理出现差错，会影响诊断结果，增加检测难度，因此，需注意提高检测人员的操作能力及综合素养，避免人为因素影响检测结果[8]。目前，实时荧光PCR 检测是唯一一个将基因拷贝数进行定量的方法，且检验操作较为智能。本研究结果显示，联合检测的诊断灵敏度、特异度均高于两种方法单独检测（P<0.05）。

综上所述，实时荧光PCR 检测用于支原体肺炎诊断中能获得较高的检出率，联合间接免疫荧光法检测能提高诊断灵敏度、特异度。