基于高效液相色谱法测定饮料中咖啡因分析

袁雪晴

摘要：文章对基于高效液相色谱法测定饮料咖啡因的含量进行分析与探讨，首先对高效液相色谱法所需的材料试剂以及仪器设备配置情况进行初步分析，然后对实验结果进行系统分析与讨论，以验证本方法用于饮料样品中咖啡因含量测定的可行性，仅供参考。

关键词：饮料;咖啡因;高效液相色谱法

1 实验方法

实验所需材料与相关试剂均由XX生化科技股份有限公司提供，甲醇为HPLC级，浓度99.9%以上，其他相关试剂为分析纯。咖啡因标准溶液配制方法如下：精密称取一定剂量纯咖啡因溶液至标准容积为1000.ml容量瓶中，经超纯水定容至标准刻度，得到咖啡因标准储备溶液，充分混合均匀后静置备用。测定前取适量溶液至标准容积为100.0ml容量瓶中，逐级稀释并得到相应浓度标准的咖啡因标准使用液。饮料样品溶液先经0.22um水性微孔膜充分过滤，在此基础之上经高效液相色谱法直接分析，有需求的情况下对饮料样品进行稀释后分析。实验所需的相关设备仪器包括高效液相色谱仪，产品型号为LC-20AT，配置有SPD-20A紫外检测器以及自动进样器装置，进样体积为10.0uL，同时配置紫外分光光度计，设备型号为DR6000，检测波长区间为190～1100nm。

2 结果分析

1）流动相流速。以柱温35.0℃以及流动相比甲醇：水为1：1的情况下，对流动相流速相对于饮料样品中咖啡因保留时间以及色谱峰面积的影响情况进行考察与研究，进行3次平行实验并以平均值为参考值，形成如下图（见图1）所示曲线。结合图1可见，在流动相流速不断增加的情况下，与之相对应的色谱峰面积以及保留时间均呈现出下降趋势，色谱峰面积大，有较高的灵敏度，保留时间短且操作费用低。因此，经综合因素考量，在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，同时缩短分析时间，提升分析效率，建议将流动相流速控制为1.0ml/min。

2）柱温。在流动相比甲醇：水为1：1且流动相流速为1.0l/min的情况下，对柱温相对于饮料样品中咖啡因保留时间以及色谱峰面积的影响情况进行考察与研究，进行3次平行实验并以平均值为参考值，形成如下图（见图2）所示曲线。结合图2可见，在柱温升高的情况下，饮料样品中咖啡因保留时间呈现出反向下降关系。柱温升高意味着传质阻力得到明显改善，对提升柱效，增加灵敏度，缩短分析时间等均具有非常确切的效果。但与此同时，柱温过高的情况下会对整个高效液相色谱法的选择性产生影响，组分分离难度增加，且固定相有效成分可能发生流失，严重时还会导致色谱柱的损坏。因此，在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，提升分析效率，保护有效组分，建议将柱温控制为35.0℃。

3）精密度。对不同浓度的咖啡因溶液进行配置，不同浓度进行7次平行实验。以相对标准偏差表示方法精密度。实驗结果如下：A组7次测定值平均值为0.092mg/l，标准偏差为0.00126，相对标准偏差为1.37%;B组7次测定值平均值为0.45mg/l，标准偏差为0.00616，相对标准偏差为1.38%;C组7次测定值平均值为0.98mg/l，标准偏差为0.00707，相对标准偏差为0.73%;D组7次测定值平均值为1.88mg/l，标准偏差为0.01300，相对标准偏差为0.69%;E组7次测定值平均值为4.50mg/l，标准偏差为0.05356，相对标准偏差为1.19%;F组7次测定值平均值为9.41mg/l，标准偏差为0.03323，相对标准偏差为0.35%;G组7次测定值平均值为28.24mg/l，标准偏差为0.2668，相对标准偏差为0.94%;H组7次测定值平均值为46.11mg/l，标准偏差为0.4331，相对标准偏差为0.94%;I组7次测定值平均值为72.36mg/l，标准偏差为0.4600，相对标准偏差为0.63%;J组7次测定值平均值为92.92mg/l，标准偏差为0.10012，相对标准偏差为0.11%。结合以上数据可见，咖啡因相对标准偏差位于0.11%～1.38%区间范围内。

3 结束语

本文构建了基于反相高效液相色谱法对饮料样品中咖啡因含量进行测定的体系，通过试验的方式确定流动相速度以及柱温等反应条件，并对方法精密度进行验证，得到以下几个方面的结论：（1）在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，同时缩短分析时间，提升分析效率，建议将流动相流速控制为1.0ml/min;（2）在基于高效液相色谱法对饮料中咖啡因成分进行测定时，为确保分析灵敏度高，提升分析效率，保护有效组分，建议将柱温控制为35.0℃;（3）咖啡因相对标准偏差位于0.11%～1.38%区间范围内。

参考文献：

[1]翟金晓，高中勇，赛雅雯， 等.液相色谱-串联质谱法同时测定饮料中的咖啡因、茶碱和可可碱[J].中国卫生检验杂志，2020，30（2）：144-147.

[2]信建豪，邢建华，辛媛媛， 等.离心萃取-紫外光度法快速测定茶饮料中的咖啡因[J].湖北农业科学，2012，51（4）：810-812.

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