微小RNA与强直性脊柱炎关系的研究进展

付书璠 李慧 奚然然

【摘 要】 微小RNA是一类长度约为22碱基高度保守的单链非编码小分子RNA，具有保守性、时序性、组织特异性等生物学特点，同时也具有免疫调控、成骨分化、调控信号通路等功能。强直性脊柱炎侵蚀骶髂关节和脊柱中轴关节，慢性炎症累及软骨关节、滑膜关节、韧带以及肌腱。微小RNA广泛参与强直性脊柱炎患者成骨细胞的分化，并对骨形成起关键调节作用，与强直性脊柱炎患者组织纤维化与骨化密切相关。

【关键词】 强直性脊柱炎;微小RNA;成骨细胞;研究进展;综述

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种以慢性炎症、骨破坏及新骨生成等为主要病理改变的慢性进行性自身免疫性疾病[1]。本病发病人群多为青壮年男性，早期主要影响骶髂关节[2]，若不能早诊断、早治疗，疾病发展到后期，会造成关节畸形及脊柱强直等不可逆损伤，呈慢性、反复性、难治性特征，严重影响患者心理状态及生活质量[3]。研究表明，遗传、环境、感染及免疫介导等因素均促进AS的发生，但其发病机制目前仍未完全阐明[4];因此，找到AS早期诊断的生物学标志物及有效治疗靶点，对治疗及预后具有重大的临床意义。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性且有高度保守性的单链非编码小分子RNA，由长度约为22个可调控基因表达的核苷酸构成[5]。1933年，LEE等[6]首次在秀丽隐杆线虫体内发现miRNA结构。最初，miRNA被认定只存在于非哺乳动物中，人们未曾重视。近年来，越来越多研究报道了miRNA与心血管系统、消化系统、神经退行性、视网膜、各种恶性肿瘤等疾病的关系[7]，验证了miRNA参与人类各种疾病的发生、发展，并在其中发挥极其重要的作用[8]，预示着miRNA会成为诊断多种疑难杂病的生物标志物[9]，miRNA调节免疫系统逐渐成为研究的热点，免疫反应贯穿AS慢性炎性反应的始终，虽然miRNA与AS关系研究报道较少，但其在AS疾病发展过程中发挥极其重要的作用，故miRNA与AS的关系值得更深层次的探究。本文总结miRNA的特征、合成、生物学功能及其与AS之间的关系，以期为AS的临床诊治提供新的思路和方向。

1 miRNA概述

1.1 miRNA特征 miRNA在进化中具有以下特征：①保守性。研究阐明，miRNA在不同类型的生物中有同源性基因[10]，预示miRNA同样的调控功能，体现了其极高的保守性。②时序性。研究人员从起初在线虫中发现lin-4与let-7到线虫发育不同阶段均存在，到后来发现它能控制斑马鱼的胚胎发育进程，验证了miRNA在不同发育时期表现出特异性表达[11]。③组织特异性。miRNA表达在特定的组织，例如，miR-122与miR-184分别特异性高表达在肝组织和肾组织中[12]。

1.2 miRNA合成 miRNA合成的生物学过程主要分为细胞核与细胞质两种环节，大致归为以下5个步骤：①细胞核内编码miRNA基因经过RNA聚合酶Ⅱ的作用转录为长度约为数百个核苷酸的初级miRNA（pri-miRNA），具有5'm7GpppN帽与3'多聚腺苷酸尾[poly（A）尾]结构[13]。②细胞核内pri-miRNA被一种核糖核苷酸酶RNaseⅢ和家族酶Drosha-DGCR8催化，进一步切割形成60～70个带有特异性茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA），pri-miRNA的编码基因来源于内含子或外显子，含有茎环结构的双链RNA不完全配对区域可产生一个或数个miRNA[14]。③细胞核内切割形成后的pre-miRNA被Ran-GTP依赖的核浆转运蛋白Exportin5识别后，pre-miRNA从核内转运至胞质过程中，具有保护结构与序列完整性的功能[15]。④细胞质中pre-miRNA被RNaseⅢ及其家族酶Dicer共同催化加工成不完全配对的长度达18～25个核苷酸的双链miRNA，即成熟的miRNA和miRNA二聚体[16]。⑤双链miRNA被转运到Ago蛋白后成为两条单链miRNA，其中一条单链miRNA被降解，另一条单链miRNA则被引入到RNA诱导沉默复合体，与其糖蛋白结合后发挥对靶基因mRNA翻译或降解抑制作用[17]。

2 miRNA生物学功能

2.1 免疫调控 miRNA可調节人类免疫细胞生长发育与功能，是维持细胞免疫稳态的重要调节剂。miRNA通过生长因子、细胞信号蛋白、转录因子等与免疫细胞协同作用，调节免疫细胞的生长分化[18]。miRNA还调控关键免疫细胞的功能，例如抗原呈递、吞噬作用、杀伤细胞毒性和内毒素耐受性，炎症反应中激活的部分miRNA产生限制过度免疫反应的作用，另外几种失调的miRNA造成不受限的炎症因子形成，从而发生多种疾病[19]。LAM等[20]研究表明，miRNA在自身免疫病中具有关键作用，尤其是在风湿病（包括AS）发生、发展中起关键调控作用。miRNA能够在转录后调节基因组的表达，同时维持细胞免疫稳态和正常的功能，越来越多的动物实验研究证实，miRNA基因表达的改变会破坏细胞免疫耐受性，从而造成自身免疫病，在自身免疫病患者中也发现了miRNA的差异性表达。

2.2 成骨分化 miRNA在成骨细胞分化与调节骨生成中发挥主要作用。KUMAR等[21]2011年指出成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞之一，参与了多种疾病的成骨过程和异位骨化，经过暴露于破骨细胞培养基后，表达了特定miRNA。经过鉴定在成纤维细胞中显示下调的有miR-20a、miR-300、miR-185、miR-30d、miR-320a。通过靶标基因预测软件分析表明，miRNA被预测为骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、骨钙素、Runx2，这些基因均参与成骨细胞分化发育，在AS病程中发挥核心作用，验证了miRNA调控成骨细胞分化与AS病程发展紧密联系。HUANG等[22]观察AS患者、类风湿关节炎患者、健康对照者外周血单个核细胞中miR-29a的表达水平，结果发现，与类风湿关节炎患者和健康对照组相比，AS患者外周血中miR-29a的表达上调，miR-29a可能被用作AS新骨形成的诊断标记。

2.3 信号通路调控 miRNA参与调节破骨细胞、软骨细胞、成骨细胞的分化和功能，它是新骨形成及修复过程中的重要调节因子。Wnt信号通路和BMP信号通路在成骨分化过程中发挥重要的协同作用，在AS患者早期骨分化阶段主要由BMP信号通路调控，而在成骨的晚期阶段则由Wnt信号通路调控[23]。MA等[24]为了探究AS大鼠模型中miR-96对成骨细胞分化以及骨形成的影响，运用双重荧光素酶报告基因分析证实了miR-96可能与硬化蛋白（SOST）结合的推测关系。成功建模后，用miR-96或DKK-1（Wnt信号抑制剂）的模拟物或抑制剂处理AS小鼠和从AS小鼠中分离的成骨细胞。实验结果表明，miR-96在AS小鼠中高表达，但SOST低表达。TOP/FOP-Flash荧光素酶报告基因测定证实miR-96激活了Wnt信号通路，表明miR-96可通过Wnt信号通路激活改善AS小鼠的成骨细胞分化和骨形成。

3 miRNA与AS发病的关系

AS病理主要表现为炎症累及骶髂关节、脊柱及其附近的韧带、肌腱等组织，炎症造成的侵蚀逐渐破坏了骨皮质，导致骨的破坏，随后继发新骨形成，最终导致脊柱关节强直性病变。miRNA具有稳定性，在细胞、组织、不同疾病表达中具有特异性。因此，探讨miRNA在AS中的表达情况，或许能从系统生物学角度为AS提供新的生物标志物与治疗靶点。

3.1 miRNA与AS成纤维样滑膜细胞（FLS）的关系 AS关节滑膜在炎症介质的诱导下，FLS的合成、增殖及胶原基质分泌等活动异常活跃，导致结缔组织逐渐增生并进一步诱发关节组织纤维化与骨化。多数研究表明，FLS是AS韧带骨化发生的始动细胞，而骨化是AS患者致残的重要影响因素，探究AS炎症与新骨形成的关系，能进一步了解AS的发病机制[25]。GU等[26]为了探讨miR-204的GSDMD对AS中FLS的影响，采用RT-qPCR技术检测AS患者滑膜组织中的miR-204、GSMDD、热解相关基因（Caspase-1、Caspase-11、NLRP3）。通过在线网站和双荧光素酶等实验对miR-204与GSDMD的结合关系进行验证，从AS患者滑膜组织中分离出FLS，同时用miR-204或GSDMD相关的寡核苷酸、siRNA和质粒进行转染，以探讨它们在FLS热凋亡中的作用，运用激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+，通过DCFH-DA检测活性氧（ROS），并采用AO/EB染色和流式细胞术检测热解。结果发现，AS患者滑膜组织中miR-204水平降低，GSMDD升高，miR-204可以直接靶向GSDMD并抑制GSDMD蛋白表达。用miR-204模拟物处理的FLS抑制了FLS中的热凋亡率和Caspase-1/PI双阳性细胞，并降低了Ca2+、ROS、NLRP3、Caspase-1和Caspase-11水平;上调GSDMD阻止了miR-204表达对FLS的影响。以上说明，miR-204参与AS中组织骨化的发生;因此，可以推测，miRNA在AS患者炎症与新骨形成中发挥重要的作用。

3.2 miRNA作为AS生物标志物 miRNA是一种以稳定形式存在于人类血浆中，可调控靶mRNA、细胞过程功能的内源性非编码小RNA，多项研究验证其已成为AS发病机制及预后的活性生物学标志物[27]。目前仍无合适的AS早期诊断方法，由于miRNA具有稳定性，可将表达异常的miRNA作为AS的生物标志物，以提高AS早期诊断的特异性与敏感性。为了探究AS患者和对照组间差异表达的血浆miRNA，REYES-LOYOLA等[28]从15例未接受过抗肿瘤坏死因子治疗的AS患者与13例健康者血浆中分离RNA，并评估let-7i、miR-16、miR-221的相对表达，结果发现，患者血浆中let-7i的表达高于对照组，但miR-16、miR-221的水平无法区分患者和对照组，该研究验证了血浆let-7i水平可作为诊断AS的生物标志物。循环miRNA已被证明可作为多种人类疾病的诊断工具，因此，有研究为了识别潜在的AS生物标志物，分析血浆miRNA，运用PCR阵列的miRNA对AS患者与健康者的血浆样品进行分析，筛选出175个miRNA，其中miR-32和miR-34a显著上调，miR-16、miR-150、miR-10b、miR-30a、miR-154显著下调，随后，为评估这6个miRNA作为AS诊断生物标志物的潜力，运用ROC曲线分析每种miRNA的敏感性与特异性，结果表明，单个ROC曲線显示出中等的AS诊断预测值，但6个miRNA组合后预测值达到0.957，特异性与敏感性分别为92.5%、90.6%，miRNA特征的诊断价值比单个miRNA诊断AS具有更高的准确性[29]。

3.3 miRNA作为AS治疗靶点 AS是一种慢性炎症导致异位新骨增生，从而造成关节僵硬的慢性炎性关节疾病[30]。SIEPER等[31]研究证实，IL-23、IL-17在慢性病的发病机制以及作为治疗靶点方面具有重要意义，IL-17主要来源于T细胞且受IL-23的控制，IL-17抑制在AS的临床试验中展现出较好的疗效。依据动物模型数据、遗传学研究、AS患者组织和血液样本研究，验证了IL-23在AS的发病机制中具有重要意义，因此被认为是AS潜在治疗靶点。CHEN等[32]对AS患者、健康者IL-17A的CD4+ T细胞进行FACS分选，运用miRNA模仿表达、细胞因子测量、转录组分析、qPCR、荧光素酶测定法等确定miR-10b的功能。结果验证了AS患者的Th17细胞具有特定的在体外上调miR-10b特征，miR-10b被促炎性细胞因子上调，并通过靶向MAP3K7抑制IL-17A的反馈回路。因此，miR-10b被认为是抑制AS病原性Th17细胞功能的潜在治疗候选药物。LAI等[33]假设miRNA表达会受到IL-23的调控，可以参与AS免疫发病机制，运用微阵列分析IL-23条件下培养3 d的K562细胞中人miRNA的表达谱。结果显示，AS中miR-29b-1-5p、miR-4449、miR-211-3p、miR-1914-3p、miR-7114-5p的表达水平比T细胞高，同时验证了IL-23调节的miRNA中，AS患者T细胞中5种miRNA的表达水平升高。miR-29b-1-5p模拟物的转染可抑制IL-23介导的STAT3磷酸化，并在AS免疫发病机制的负反馈控制中发挥作用。

4 小结与展望

综上所述，miRNA在人类疾病发病机制中的重要作用已经成为国内外研究的热点，同时越来越多研究证实其在AS疾病发展过程中具有重要的意义。国内研究报道，新风胶囊能显著改善AS活动期患者的高凝状态，能有效抑制核转录因子-κB活化，从而间接参与抑制miR-155表达[34]。miRNA具有極高的保守性，体现了生物标志物的理想特质，其作为疾病临床诊断标志物以及新兴的疾病治疗靶点，将在未来显现更广阔的应用前景。miRNA的研究正处于起步阶段，miRNA存在时序性表达，其在疾病发展过程中的调控机制尚未明确，同时miRNA具有组织特异性，靶向作用于特定的细胞或免疫组织，其差异性表达尚未被揭示等诸多问题。因此，深入探究miRNA在AS中的表达以及调控作用，阐明其与AS之间的关系以及发病机制，为AS的诊断以及防治提供新的思路，同时为miRNA靶向治疗提供理论支持。

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收稿日期：2021-03-03;修回日期：2021-04-15