混合菌辅助发酵羊肉香肠研制及产品质量分析

刘浩，吴叶，张建萍，陈尚龙，刘辉

(徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

羊肉是一种低脂、低胆固醇、高蛋白的肉类食品，富含脂肪27.9%(低于猪肉)，优质蛋白10.9%(高于猪肉)，相比于其他畜禽肉，羊肉富含更多的钙、铁、磷、碘等矿物质，并且含有人体所需要的维生素B1、B2[1]。

发酵香肠是利用微生物的发酵作用，通过将肉、脂肪、香辛料、发酵剂等混合均匀后灌入肠衣，再经过后期干燥成熟，制成的pH低于5.3，能够在常温下贮藏运输，兼具风味与色泽的发酵肉制品[2]。在我国不同的地方有着各自特色的香肠，如广东香肠、江苏如皋香肠、东北红肠等。我国传统发酵香肠风味独特、易于贮藏、食用方便，可直接拼盘食用，也可煎、炒、烹、炸，深受消费者的欢迎，但是存在着生产周期过长、盐分含量过高、香肠品质参差不齐的问题，甚至存在生物胺、致病菌等严重的食品安全隐患[3]。随着科技进步，传统的发酵香肠工艺已不适应现代化的要求，现代发酵香肠已实现了规模化、标准化生产，在缩短周期的同时还提高了产品品质，但是致病菌、生物胺等食品安全隐患依然存在。过酸、高脂高盐的加工不能满足消费者对食品品质的要求，因此低脂低盐、具有益生性的发酵香肠具有很大的市场潜力[4]。

乳杆菌属是发酵香肠中最重要的微生物菌群，发酵香肠常用的乳杆菌主要有清酒乳杆菌、植物乳杆菌、弯曲乳杆菌等[5]。这类细菌生长以糖类为营养物质，分解产生乳酸，乳酸能够降低发酵香肠的pH，香肠的pH降低后，致病菌和杂菌的生长受到抑制，从而延长发酵香肠的货架期[6]。由于单一菌种发酵过程中会出现生物胺、亚硝酸盐积累的风险，所以现在发酵香肠中越来越多地采用复配发酵剂。复配发酵剂是将几种发酵剂按比例混合，弥补单一菌种发酵剂的缺陷，发挥各菌种的优势，提高香肠的风味品质[7]。

我国羊肉产量位居世界第一，但是对羊肉的消费大多停留在生鲜肉阶段，多见于火锅、红烧、烤制等烹调方式中[8]。由于羊肉特有的膻味，传统香肠基本以猪肉为原料，很少见到用羊肉灌制香肠，利用发酵剂发酵香肠，在一定程度上可以抑制膻味，改善香肠的色泽和品质，延长货架期[9]，促进我国畜牧业发展，为消费者提供一种新型羊肉制品，在满足消费者味蕾的同时兼具营养价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：羊后腿瘦肉、猪背膘：徐州云龙万达永辉超市；天然猪肠衣：申源肠衣品牌直销店。

辅料：食用盐、蔗糖、白酒、白胡椒粉、蒜粉、姜粉：徐州云龙万达永辉超市；葡萄糖：山家人；亚硝酸钠：山东优索化工科技有限公司；D-异抗坏血酸钠：糖柜旗舰店。

发酵剂：植物乳杆菌、木糖葡萄球菌：徐州工程学院微生物实验室提供。

试剂：苯酚(AR)、石油醚(AR)：天津福晨化学试剂厂；盐酸萘乙二胺(AR)：天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸(AR)：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

pH-3C精密pH计 上海雷磁仪器厂；7230G可见分光光度计 上海圣科仪器设备有限公司；BGZ-70电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗器械厂；立式高压蒸汽灭菌锅 上海东亚压力容器制造有限公司；S2-A81绞肉机 九阳股份有限公司；DK-98-II型万用电炉 天津泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发仪 江苏德睿科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵羊肉香肠工艺流程

原料肉预处理(去筋、漂洗)：瘦肉绞碎→肥肉切丁→加入辅料及腌制剂→搅拌均匀→低温腌制→接种混合菌发酵剂→灌肠→恒温发酵24 h→干燥成熟。

基本配方：新鲜羊瘦肉(去筋)与猪背膘质量比为8∶2，蔗糖1%，葡萄糖0.6%，食盐3%，白胡椒0.1%，姜粉0.2%，蒜粉0.2%，白酒1.2%，冰水10%，亚硝酸钠0.010%，D-异抗坏血酸钠0.075%(均为在羊肉中的质量分数)。

1.3.2 菌株之间的拮抗作用

用接种环挑取单菌落，在固体培养基上划一条直线，37 ℃培养24 h后，再用接种环挑取另一菌株，沿菌落边缘从垂直方向接种，继续培养24 h，观察是否存在抑菌区[10]。

1.3.3 单因素实验

探究接种量对发酵羊肉香肠品质的影响时，将接种量作为变量，控制植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌1∶1、发酵温度30 ℃、相对湿度90%、发酵时间24 h不变，5组发酵香肠分别接种104，105，106，107，108CFU/g，测定24 h后发酵香肠的pH，待发酵香肠成熟后进行感官评分。

探究发酵温度对发酵羊肉香肠品质的影响时，将发酵温度作为变量，控制植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌1∶1、接种量107CFU/g、相对湿度90%、发酵时间24 h不变，5组发酵香肠分别于15，20，25，30，35 ℃下发酵，测定24 h后发酵香肠的pH，待发酵香肠成熟后进行感官评分。

探究菌种配比对发酵羊肉香肠品质的影响时，将菌种配比作为变量，控制接种量107CFU/g、发酵温度30 ℃、相对湿度90%、发酵时间24 h不变，5组发酵香肠分别接种植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌比例为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的混合菌，测定24 h后发酵香肠的pH，待发酵香肠成熟后进行感官评分。

1.3.4 响应面实验设计

根据Box-Behnken实验设计原理，结合单因素实验结果，用Design-Expert 8.0.6软件，选取感官评分为响应值，进行三因素三水平共17个实验点的中心组合实验[11]，对混合菌发酵羊肉香肠工艺进行优化，对响应曲面得出的最佳配比进行感官评分，各因素水平见表1。

表1 响应面实验因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.3.5 发酵香肠pH的测定

参照GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》规定的方法，将香肠视为非均质化试样，使用校准后的pH计，贴于已用小刀打孔的香肠中，读数稳定后，可直接读出pH，同一点重复测定3次，读数精确至0.01[12]。发酵香肠pH必须在48 h内降低至5.3才能保证香肠的安全性[13]。

1.3.6 感官评分体系

选择来自不同省份的16名(8男8女)经过食品感官鉴评专业培训的学生组成感官鉴评小组，要求从色泽、组织结构、膻味、口感4个方面进行评分，每位同学必须对所有样品进行评分，评分过程中不允许交流。每次评分之前，需用温水漱口，10 min后进行下一次评定，减少连续品尝带来的不利影响，具体评分标准见表2。

表2 感官评分体系Table 2 The sensory scoring system

1.3.7 发酵香肠品质评价标准

发酵羊肉香肠隶属于中式香肠，必须符合GB/T 23493-2009[14]《中式香肠》标准，其他肉制品标准也必须符合，见表3。

表3 中式香肠理化标准Table 3 The physicochemical indexes of Chinese sausage

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵温度对香肠pH、感官评分的影响

由图1可知，发酵24 h后，20 ℃和25 ℃的两组香肠pH下降至5.89，5.42，均高于5.3，不符合标准；30 ℃和35 ℃的两组香肠pH最终降至4.88，4.46，均低于5.30，综合感官评分来看，35 ℃组由于过酸，感官评分低于30 ℃组，所以发酵温度为30 ℃时香肠整体品质最佳。

图1 发酵温度对香肠pH、感官评分的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.2 接种量对香肠pH、感官评分的影响

由图2可知，发酵24 h后，接种量为104,105CFU/g的发酵香肠pH降至5.65,5.48，高于5.30，不符合标准，接种106,107,108CFU/g的发酵香肠pH最终下降到5.16，4.84，4.28，均低于5.3，考虑到香肠成熟过程中，香肠pH会出现一定程度的回升[15]，不能很好地确保安全，故接种量为106CFU/g的香肠不予考虑。接种量为108CFU/g的香肠pH下降得太低，酸味过于强烈。结合感官评分来看，接种量为107CFU/g的发酵香肠评分最高，所以接种量为107CFU/g比较合适。

图2 接种量对香肠pH、感官评分的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on the pH values and sensory scores of sausage

2.1.3 菌种配比对香肠pH、感官评分的影响

由图3可知，5组香肠发酵24 h后pH均低于5.3，符合标准，植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌为3∶1时pH最低，主要是由于该组乳酸菌比例最高。pH过低时，发酵香肠过酸，消费者很难接受，综合感官评分来看，复配比为1∶1时最合适。

图3 菌种配比对香肠pH、感官评分的影响Fig.3 Effect of strain ratios on the pH values and sensory scores of sausage

2.2 响应面优化实验结果及方差分析

2.2.1 响应面实验结果

表4 响应面实验设计及结果Table 4 Response surface experiment design and results

利用Design-Expert 8.0.6进行回归拟合得到接种量、复配比、发酵温度对香肠感官评分的二次多项式回归方程为：Y=+84.45-1.61A+1.16B+0.70C+0.34AB-0.75AC+0.093BC-8.84A2-3.05B2-3.40C2。R2=0.9656，校正系数RAdj2=0.9213，表明响应值变化的96.56%能用该模型解释。对该模型进行方差分析，结果见表5。

表5 响应面方差分析結果Table 5 Response surface variance analysis results

由表5方差分析结果可知，该模型极显著，失拟项不显著，A2、B2、C2对模型的影响极显著，影响感官评分的各因素顺序为：接种量>复配比>发酵温度。

2.2.2 因素间的交互作用分析

由图4～图6可知，3种因素两两之间的交互作用不明显，综上所述，植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌1.39∶1、接种量6.69 1g CFU/g、发酵温度30.58 ℃时制得的发酵香肠最佳，此时感官评分为85.43。

图4 复配比和接种量对发酵羊肉香肠感官评分交互作用的响应曲面Fig.4 Response surface of the interaction of mixed ratio and inoculation amount on sensory score of fermented mutton sausage

图5 接种量和发酵温度对发酵羊肉香肠感官评分交互作用的响应曲面Fig.5 Response surface of the interaction between inoculation amount and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

图6 复配比和发酵温度对发酵羊肉香肠感官评分交互作用的响应曲面Fig.6 Response surface of the interaction of mixed ratio and fermentation temperature on sensory score of fermented mutton sausage

2.2.3 验证实验

为了满足实际生产的需求，将最佳工艺参数调整为：植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌1∶1，接种量107CFU/g，发酵温度30 ℃，发酵时间24 h。进行3次验证实验，发酵香肠的感官评分平均值为85.15，与模型理论值相近，说明该工艺条件即最佳工艺条件。

2.3 发酵羊肉香肠质量分析结果

对采用最佳工艺制备的香肠与未添加混合菌种的普通羊肉香肠对照进行质量分析，见表6。

表6 质量分析Table 6 The analysis of quality

发酵香肠中的各项指标均符合国家标准，发酵组的水分含量明显低于对照组，说明添加混合菌有助于羊肉香肠水分含量的降低，较低的水分含量可以抑制微生物生长，提高香肠的安全性。添加发酵剂的香肠中，微生物细胞内含有的蛋白酶可能使蛋白质分解，蛋白质含量低于未添加混合菌的香肠。由于植物乳杆菌利用葡萄糖产酸，发酵组的总糖含量低于普通香肠。发酵香肠的过氧化值和亚硝酸盐含量低于普通香肠，混合菌能够抑制亚硝酸盐的产生，在一定程度上提高了发酵香肠的安全性，发酵香肠的安全性和贮藏性更好。

3 结论

以感官评分、pH值作为评价香肠的理化指标，确定香肠的最佳发酵时间，通过单因素实验，确定菌种配比、发酵温度、接种量最佳配比的范围，在单因素实验的基础上，以感官评分为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，当接种量为107CFU/g，发酵温度为30 ℃，植物乳杆菌∶木糖葡萄球菌配比为1∶1时，发酵羊肉香肠的品质最佳。

以中式香肠国家标准为依据，对贮藏30 d的发酵羊肉香肠进行产品质量分析，添加混合菌的发酵羊肉香肠的水分含量、总糖含量、氯化物含量、蛋白质含量和脂肪含量均低于未添加发酵剂的香肠，混合菌发酵香肠更健康、安全，符合国家特级中式香肠的要求；添加混合菌的发酵羊肉香肠的过氧化值和亚硝酸盐含量低于未添加发酵剂的香肠，远低于国家标准规定的残留量，说明混合菌发酵香肠能够延长货架期，提高产品质量。