拉曼光谱结合角度转换快速分析果葡糖浆中果糖

焦天伟，粟晖*，黄金，梁宗杭，黄晓程，姚志湘,2

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院 广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；2.广西蔗糖产业协同创新中心，南宁 530004)

果葡糖浆又称高果糖浆或异构糖浆，被广泛应用于甜味剂[1]，其主要成分包括果糖、葡萄糖和少量的低聚糖，其中提高甜度的主要成分是果糖，按果糖占干物质的比重不同，一般将果葡糖浆分为F42、F55和F90[2]。目前果葡糖浆中果糖定量分析方法主要有高效液相色谱法[3]、分光光度法[4]和核磁法[5]等。欧少沛等利用高效液相色谱法测定果葡糖浆中果糖与葡萄糖含量，并采用外标法和面积归一法进行比对分析，结果表明，高效液相色谱配合面积归一法可以快速、准确定量果葡糖浆中的果糖及葡萄糖。徐慧诠等采用间苯二酚-分光光度法测定葡萄糖异构糖浆中果糖的含量，结果表明，异构糖浆经过显色反应后在473 nm处的吸光度与果糖含量线性关系良好，定量准确性高。Yan等利用核磁共振波谱法定量分析蜜糖浆中的果糖、葡萄糖及蔗糖，结果表明，采用邻苯二甲酸氢钾作为内标物，可以准确测定蜜糖浆中的果糖、葡萄糖及麦芽糖。但是，以上方法普遍存在分析成本高、效率低和前处理复杂等问题，难以满足快速分析的要求。因此，建立一种快速、准确可以应用到果葡糖浆体系的果糖测定方法具有重要的现实意义。

拉曼光谱技术以其信息丰富、水的影响小、无需样品预处理等独特优点，近些年来在药物分析[6]、食品[7]和化工[8]等领域得到迅猛发展。果糖和葡萄糖互为同分异构体，拉曼特征波段主要集中在300～1500 cm-1和2700～3400 cm-1。谱图中波峰重叠和偏移现象严重，难以单纯依靠光谱响应强度实现果糖的定量分析。Ilaxlan等[9]采用拉曼光谱结合偏最小二乘(partial least squares， PLS)的方法分析了商业饮料中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，结果表明，果糖的拉曼响应良好，利用拉曼光谱结合化学计量学的方法定量分析果糖是可行的。但是，PLS较为依赖光谱的特征响应，激发光的稳定性、聚焦、固体颗粒的散射、积分时间的改变和光程差的变动等乘性干扰无法避免。乘性干扰在漫反射近红外(DRS)、拉曼光谱等光学仪器测量时普遍存在，而且若应用于糖液体系，折射率的波动会成倍放大分析误差，影响分析模型的稳定性。Wang等[10]采用DRS测定肉苁蓉中果糖、葡萄糖等7种主要成分，分别进行标准正态变换(standard normal variate transformation， SNV)和多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)消除乘性干扰后，再利用PLS建模，模型的决定系数均略大于0.94，结果表明，SNV和MSC处理后的数据结果相似。SNV主要消除散射和光程变化对漫反射光谱的影响，但是该方法假设所有变量的标准偏差一致，当体系组分性质变化较大时，误差会变大。MSC则必须建立“标准光谱”，即含量与强度呈理想线性关系，建立“标准光谱”的质量直接影响误差校正结果，但在实际中，这种“标准光谱”是难以获取的。综上，糖液体系折射率波动导致放大的乘性干扰问题并没有得到很好的解决。

姚志湘等[11]发现若将光谱视为向量，体系总体误差分布变化则与被关注向量与其他向量所构成的子空间向量夹角有关，且该向量和其他向量子空间的关系如果确定，则体系总体误差呈正态分布。以此为理论基础，提出通过计算向量空间角消除乘性干扰的方法[12]，并进一步提出一种基于子空间角度转换的近似线性定量方法，实现采用中红外光谱结合向量夹角直接定量三氯蔗糖合成过程的组分含量测定[13]，并将该方法推广应用于蔗糖-6-乙酸酯的定量分析[14]。该方法的特点是克服乘性干扰；不依赖光谱特征响应；光谱特征信息保留度高；高效、便捷、稳定性好，为快速准确的定量分析提供了参考。本文采用子空间角度转换方法和拉曼光谱结合，建立果葡糖浆中果糖含量的快速分析方法，以间苯二酚-分光光度法作为比对，并检测该方法精密度。

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

ExR610拉曼光谱仪 西派特(北京)有限公司；AR124CN电子分析天平 奥豪斯仪器有限公司；S-3100紫外可见分光光度计 韩国SCINCO公司。

果糖(生化试剂 BR)：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖(食品级)：广东光华科技股份有限公司；间苯二酚(分析纯)：上海凌峰化学试剂有限公司；盐酸(36.0%～38.0%，分析纯)：西陇科学股份有限公司；果葡糖浆：市售。

1.2 子空间角度转换结合拉曼光谱分析模型建立

1.2.1 建模样本的配制

取5 mL的F42果葡糖浆(UV，果糖质量分数为29.23%)为基液，按一定配比添加果糖或50%质量分数的葡萄糖溶液，配制一系列果葡糖浆样本，果糖质量分数在1%～60%的范围内，每两个样本间隔3%，共配制21个样本，编号为S1～S21。

1.2.2 样本拉曼光谱采集

将样本S1～S21分别置于测量瓶中，采集拉曼数据，每个样本采集3次取平均值，采集参数：积分时间9 s，平滑点数0，中心波长532 nm，功率等级9，拉曼位移范围为300～3500 cm-1。

1.2.3 建模步骤

分析模型建立的步骤见图1。

图1 分析模型建立流程图Fig.1 The flow chart of analysis mode

1.3 市售果葡糖浆中果糖含量分析

取F42、F55、F60 3种不同品牌不同批次的果葡糖浆样品，采集各样本拉曼光谱。数据处理参照1.2.3，分析各样本中果糖含量，此过程平行5次，计算相对标准偏差，检验方法精密度。

1.4 间苯二酚-分光光度法分析果葡糖浆中的果糖含量

参照文献[4]，配制果糖质量分数呈梯度分布在0.0158‰～0.1183‰之间的8份样本，采集其可见光谱，建立果糖含量-吸光度标准曲线，用于分析果葡糖浆样本。

2 结果与讨论

2.1 间苯二酚分光光度法建立果糖含量-吸光度标准曲线

选取各样本在波长485 nm处对应的吸光度值，建立果糖含量-吸光度标准曲线。果糖含量在0.0158‰～0.1183‰范围内，线性方程为y=102.56x+0.0795，相关系数r=0.9955。

2.2 基于拉曼光谱结合子空间角度转换的快速分析模型建立

2.2.1 系列样本拉曼光谱

果葡糖浆、建模样本、葡萄糖及果糖对照品的系列样本拉曼特征峰集中分布在300～1500 cm-1与2500～3500 cm-1两部分。葡萄糖和果糖在2500～3500 cm-1波段皆有两个明显特征峰，但重叠与覆盖现象严重，果葡糖浆等两糖混合样本易出现波峰偏移问题，所以不考虑将其作特征区间。300～1500 cm-1波段特征响应显著。取待测样本及对照品谱图的300～2000 cm-1波段，见图2。

图2 F60果葡糖浆、葡萄糖对照品、果糖对照品与30%果糖质量分数的建模样本的谱图Fig.2 Raman spectrogram of F60 HFCS, glucose reference sample, fructose reference sample and modeling sample with 30% fructose

2.2.2 果糖质量分数与夹角值EE的关联方程建立

建模样本与参比样本的选取：按照间隔4%选取建模样本，使样本果糖质量分数均匀分布在1%～60%的范围内。选取S1、S2、S4、S5、S7、S8、S10、S11、S13、S14、S16、S17、S19、S20作为建模样本。参比样本应具有唯一性并且其光谱与背景光谱差异性最大。果糖为测量组分，背景光谱中不含有果糖特征峰，即果糖含量最大的样本谱图与背景光谱差异性最大，样本S21果糖质量分数最大，为60%，且无相同果糖含量的样本存在，具有唯一性，故选择S21为参比样本。

光谱平滑降噪：样本中的荧光是导致基线漂移的主要原因。针对荧光干扰，参照荧光褪色差分法[17](FBDA)校正基线。采用一阶滤波求导对样本原始光谱进行降噪处理。果葡糖浆的拉曼光谱经降噪与基线校正处理前后见图3。

图3 果葡糖浆基线校正前后的拉曼光谱Fig.3 Raman spectra of HFCS before and after baseline correction

由图3可知，经过降噪和基线校正处理前的谱图，噪声大且基线漂移严重，校正后的谱图信噪比显著提高，且能完整的保留原始光谱的形状。

关联方程建立：分别取二阶、一阶滤波求导与零阶导，移动窗口宽度取波段波数的1/38与1/19，取最大果糖含量样本S21作为参比样本，建立移动窗口，窗口从最小波数点向波数点增大方向移动，计算样本光谱与参比光谱的夹角值EE，取果糖质量分数为横坐标，夹角值EE为纵坐标，采用线性拟合方法，建立相应关联方程，见图4。对比各方程决定系数，确定最优方案。

图4 果糖含量与角度值的关联方程Fig.4 The correlation equations between fructose content and angle value

图4(a)、(b)使用未经滤波求导的谱图计算所得，相较采用滤波求导的(c)、(d)、(e)、(f)离散程度大，说明谱图经过相应滤波降噪可提高EE与果糖含量的线性关系。经二阶滤波求导降噪后，计算得方程(e)、(f)，一阶滤波得(c)、(d)。经计算得到各方程相关系数(R)。方程(c)、(d)相关系数R均大于0.99，择优录取，选择方程(c)建立果糖含量分析方法。

2.2.3 方法验证

取S3、S6、S9、S12、S15、S18样本，依照2.2.2步骤计算得到EE值，代入建立的关联方程，预测值与误差分析结果见表1。绝对误差在0.07%～2.46%之间，相对误差在0.20%～5.98%之间，结果表明，模型精度高，测定结果准确。

表1 验证集样本的EE值与误差分析结果Table 1 The EE values and error analysis results of validation set samples

2.3 市售果葡糖浆果糖含量分析

同2.2取S21为参比样本，计算得到果葡糖浆样品与参比样本的夹角值EE，代入2.2.2建立的关联方程中，计算得到各样本中果糖含量，并与间苯二酚-分光光度法测定值作比对，结果见表2。

表2 市售果葡糖浆果糖含量预测值与误差分析结果Table 2 The predictive values and error analysis results of fructose content in commercial HFCS

由表2可知，拉曼光谱结合子空间角度转换方法预测值与间苯二酚-分光光度法预测值绝对误差在0.64%～2.31%之间，相对误差在1.89%～6.77%之间。平行分析各市售果葡糖浆5次，计算相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

表3 精密度分析结果Table 3 The precision analysis results

由表3可知，各样本的RSD在0.34%～2.32%，说明所建立的拉曼光谱结合子空间角度转换的方法精密度高、准确性好，适用于无损、快速分析果葡糖浆中果糖含量。

3 结论

本文采用拉曼光谱采集样品信息，以子空间角度转换的化学计量学方法消除乘性干扰，建立了市售果葡糖浆的拉曼光谱快速分析方法。果糖含量-夹角值关联模型相关系数R为0.9991，相对误差在1.89%～6.77%之间，对市售果葡糖浆的分析相对标准偏差为0.34%～2.32%。本方法分析效率高、操作简单、稳定性好，可用于果葡糖浆生产过程中产品的品质监控和商品的市场监督。