关于石楠大孔粉虱Dialeuropora photiniana分类归属的探讨

白润娥， 胡维月， 闫明辉， 刘旭， 杨昊， 闫凤鸣

(河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

石楠大孔粉虱Dialeuroporaphotiniana，属于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)粉虱亚科(Aleyrodinae)大孔粉虱属(Dialeuropora)。杨平澜于1985年首次对该种进行了鉴定，认为是一种隶属于复孔粉虱亚科Aleurodicinae复孔粉虱属Aleurodicus的新种，因采于石楠植物，因而命名为石楠盘粉虱Aleurodicusphotiniana，但没有见论文发表和具体的形态描述。陈连根于1997年详细描述了该种的形态特征、生活史和生物学特性[1]。石楠大孔粉虱D.photiniana对寄主植物的危害是多方面的，表现在若虫、伪蛹和成虫在寄主植物背面刺吸汁液，使被害叶片发黄，提早脱落；分泌大量蜡质絮状物影响寄主植物的光合作用，以及若虫分泌的蜜露诱发煤污病，严重影响寄主植物的正常生长和景观效果等[2]。

2006年，DUBEY 和 KO根据上海植物园保存的标本以及陈连根的特征描述将该种归属至粉虱亚科(Aleyrodinae)大孔粉虱属(Dialeuropora)，并将其命名为Dialeuroporaphotiniana(Young)[3]。MARTIN[4]、EVANS[5]、王吉锐[6]也认同此观点。目前国内对于粉虱类昆虫的研究主要集中在种类鉴定、地理分布、寄主植物以及防治研究等方面，而对粉虱分类中存在的分歧关注较少，因此大多研究者仍沿用杨平澜最初鉴定的种名A.photinianaYoung[1,7-10]。DUBEY和KO对石楠大孔粉虱归属的变更是否正确，有待提出科学有力的证据。本文研究了石楠大孔粉虱的伪蛹、成虫特征，以及分子鉴定结果，以期对其分类地位的归属提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集

石楠大孔粉虱标本分别于2016年4月采集于河南省郑州市郑东新区如意路，寄主植物石楠PhotiniaserrulataLindl；2016年7月采集于郑州大学新校区，寄主植物石楠P.serrulata和西府海棠Malusmicromalus；2017年5—7月采集于河南农业大学文化路校区，寄主植物石楠P.serrulata。经鉴定并与陈连根保存于上海植物园的玻片标本对比，确定为同一种。

1.2 标本的形态鉴定

粉虱科昆虫分类所依据的形态标准，在科和亚科水平上主要依据成虫和第四龄若虫(伪蛹)的特征，族、属和种水平上的分类主要根据第四龄若虫的特征进行鉴定[7]。

将带有成虫的叶片，放入 -20 ℃冰箱冷冻5～10 min，挑取成虫备用；带有若虫的叶片，用软毛笔轻轻刷去蜡丝，选取第四龄若虫，备用。将成虫和第四龄若虫利用VHX-600超景深显微镜(基恩士(中国)有限公司)、S-3400NⅡ扫描式电子显微镜(日立(中国)有限公司)进行观察、拍照。

1.2.1 粉虱玻片标本的制作 粉虱玻片标本制作参照闫凤鸣[11]，乔鲁芹和张小娣[12]，吴杏霞和胡敦孝[13]的玻片制作方法，采用碱液浸泡、染色、酒精梯度脱水和透明等步骤进行。

1.2.2 粉虱及粉虱玻片的观察 用VHX-600超景深显微镜在低倍镜(200倍)下，对自然状态下的粉虱和制作的粉虱玻片标本进行测量和观察，并拍照。

1.2.3 伪蛹的观察 取带有伪蛹的干燥叶片，在体视显微镜下观察，选用形态完整伪蛹(如果伪蛹周围或伪蛹上附着有蜡丝，可以用软毛笔将蜡丝轻轻刷去)，将其连同叶片剪成小方块，用导电胶将样品粘贴在样品台上，选取适当的工作参数，用S-3400NⅡ扫描式电子显微镜进行观察、扫描并拍照[14-15]。

1.3 标本的分子鉴定

1.3.1 石楠大孔粉虱总DNA提取 石楠大孔粉虱总 DNA 的提取参照乔玮娜等[16]的方法，并稍加改进。用软毛笔挑取单头粉虱成虫，置于滴有20 μL提取缓冲液(50 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，1% CTAB，20 mmol·L-1NaCl；pH 8.0)的Parafilm膜上，用0.2 mL PCR管底部作为匀浆器，研磨匀浆，匀浆液移入1.5 mL离心管；用50 μL缓冲液冲洗匀浆器和Parafilm膜4次，移入同一离心管；加入5 μL蛋白酶K(20 mg·mL-1)混匀，置于60 ℃水浴锅中水浴1 h(中途混匀1次)；加入氯仿和异戊醇(V∶V=24∶1)混合液220 μL，混匀8～10次后，冰浴30 min；在4 ℃条件下，以12 000 r·min-1，离心20 min(德国Hettich D-78532台式离心机)，取上清液(约200 μL)，加入440 μL预冷过的无水乙醇，混匀后 -20 ℃冰箱静置30 min；取出，4 ℃下以12 000 r·min-1，离心20 min，弃去上清液；加入440 μL预冷的75%乙醇洗涤，4 ℃ 12 000 r·min-1，离心15 min，弃去上清液。将离心管倒置于洁净滤纸上，自然干燥20 min，每管加入20 μL超纯水，充分溶解后于-20 ℃保存备用。以生物分光光度计测定DNA浓度，以OD260/280值确定DNA的纯度。

1.3.2 PCR扩增 应用粉虱类昆虫 COI 基因的 5′端序列以通用型引物 LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和 HCO2198 (5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)扩增，片段长度约为 710 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。5′端序列扩增反应体系为 30 μL，其中 ddH2O 23.8 μL，10× buffer 3 μL，10 mmol dNTP 0.6 μL，上游引物和下游引物(10 μmol) 各 0.6 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U·μL-1, NEB)0.4 μL，模板 DNA 1 μL；PCR 扩增程序为：94 ℃预变性 10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。PCR 产物于 4 ℃保存备用。

1.3.3 电泳检测及序列测定 取5′端 PCR 扩增产物 5 μL，在含有 Gold view(0.5 μg·mL-1)的1.5%琼脂糖凝胶上，以100 V电泳分离(电泳缓冲液为 0.5×TBE)45 min 后，以 Gel Doc Universal Hood II 型凝胶成像系统分析结果，将经电泳检测验证合格的 PCR 产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。将拼接成功的序列录入中国主要外来入侵昆虫 DNA 条形码识别系统(http://www.chinaias.cn)，其序列登录号为(SNDKFS. 2016. 450002. 5. 1-4)。

1.3.4 COI基因序列分析 用DNASTAR软件读取序列，并用Chromas软件查看峰图校对序列，确保序列准确性。以MEGA 5.0 绘制进化树和遗传距离分析，利用GeneDoc做序列比对图，序列来源为中国外来入侵物种数据库(http:// www.chinaias.cn)。

2 结果与分析

2.1 成虫翅脉特征

复孔粉虱亚科Aleurodicinae和粉虱亚科Aleyrodinae在亚科水平的分类，主要依据中脉(M)存在，还是肘脉(Cu)存在[7]。选取烟粉虱作为粉虱亚科代表种，与石楠大孔粉虱的翅脉进行对比。

A：石楠大孔粉虱越冬代成虫；B：石楠大孔粉虱第1～2代成虫；C：烟粉虱成虫；

从图1可以看出，石楠大孔粉虱和烟粉虱成虫前翅翅脉特征相同，都是肘脉(Cu)存在，中脉(M)消失，与粉虱亚科成虫特征翅脉相符，从而可以推测：石楠大孔粉虱应该归属至粉虱亚科。

2.2 第四龄若虫(伪蛹)形态特征

石楠大孔粉虱D.photiniana(Young) 伪蛹黄白色，椭圆形，长0.8～1.1 mm，宽0.68～0.82 mm，边缘较平整，气门褶明显，在边缘处微凹，亚缘区与背盘区分界不明显，头胸部背面具倒“T”形的羽化缝，横蜕缝不达边缘，纵蜕缝达边缘。体背两侧具4对蜡腺孔，呈“凹”字形，尾部1对，呈圆形。皿状孔半圆形，舌状突伸出，呈十字形，盖片近梯形(图2，图3)。从电镜图片观察可知，伪蛹的十字形舌状突呈毛绒状，但没有明显的舌状突长刚毛；背孔和尾孔都是单孔(图3)。

A：伪蛹生态图；B：伪蛹玻片图；C：背部孔。

A：伪蛹；B：皿状孔；C：背部孔；D：尾部孔。

2.3 石楠大孔粉虱与复孔粉虱属和大孔粉虱属代表种伪蛹特征的比较

粉虱科昆虫在属和种水平上的分类主要根据第四龄若虫(伪蛹)的特征进行鉴定。将石楠大孔粉虱伪蛹(图4A)与复孔粉虱属代表种螺旋粉虱AleurodicusdispersusRussell(图4B)和大孔粉虱属代表种土密大孔粉虱Dialeuroporabrideliae(Takahashi)(图4C)的伪蛹特征进行比较分析。观察标本可知,石楠大孔粉虱有5对简单孔，亚缘区4对尾部1对；土密大孔粉虱有5对简单大孔，分布在亚缘区；螺旋粉虱有5对复合孔，4对在腹部，1对在胸部。石楠大孔粉虱舌状突十字形，无刚毛；螺旋粉虱舌状突舌状，有刚毛；土密大孔粉虱舌状突几乎被盖片覆盖，无刚毛。

A：石楠大孔粉虱；B：螺旋粉虱；C：土密大孔粉虱。

据《中国粉虱志》的描述，复孔粉虱属伪蛹的基本特征是蛹壳体背亚背区有5～7对能产生蜡丝的复合孔，1对在头部，其余在腹部，分泌的蜡丝粗壮、长，并缠绕在一起，舌状突呈舌状，延伸至皿状孔后缘，舌状突上有4根明显的刚毛，有时只有2根刚毛；大孔粉虱属伪蛹特征是亚缘区具有1～5对大圆孔。舌状突形状多变，不为舌状，舌状突上无明显刚毛，皿状孔内部平滑，盖片覆盖整个孔[7]。这2个属最重要的区别是孔的形状、数量、位置及舌状突上是否有刚毛。

依据2个属的属特征、以及代表种特征，从孔的数量、位置及形状以及舌状突的形状分析，石楠大孔粉虱符合大孔粉虱属的特征，应该归属至大孔粉虱属。

利用5′端特异引物对标本DNA进行PCR扩增和电泳检测，结果显示在700 bp附近可见清晰的目标条带(图5)，测序结果显示新扩增序列长度为680 bp。将所得序列与中国外来入侵物种数据库(http:// www.chinaias.cn)中已经公布的粉虱COI基因序列(共计6属27条序列，详见表1)进行序列比对、以及进一步的系统发育分析，以此探究石楠盘粉虱的分类地位。

M: DNA分子量标准; 泳道1～5: 石楠大孔粉虱; 6: 阴性对照(水)。

表1 用于DNA条形码技术研究的粉虱种类Table 1 Species of whitefly used in DNA barcoding studies

序列分析及系统进化树显示(图6，图7)，18种粉虱来源的27条序列可聚类为6个亚群，Dialeuropora来源的12个序列(seq6440、seq6441、seq6442、seq6443、seq6444、seq6445、seq6446、seq6447、seq6448、seq6449、seq6450和seqx)归类为group 1，Aleuroclava来源的4个序列(seq4193、seq4198、seq4199、seq4200)归类为group 2，Bemisiatabaci来源的2个序列(seq5912、seq6144)为group 3，Aleuroclava来源的7个序列(seq4178、seq4180、seq4181、seq4184、seq4185、seq4186和seq4187)为group 4，Aleurolobus来源的1个序列(seq4204)归为group5，Metabemisia来源的1个序列(seq6458)与上述序列遗传距离最远，单独归类为group 6。

图6 18种粉虱COI基因5′端序列比对分析

注：节点附近的数字代表节点支持率(>50)；标尺示遗传距离。Note: The number represents node support rate (>50); the scale shows the genetic distance.图7 NJ法(A)构建的18种粉虱系统发育树

其中新克隆的seqXDialeuroporaphotiniana(Young)与Dialeuropora类来源序列相似度最高，介于76.7%～86.5%，与已知香港裸粉虱Dialeurodeshongkongensis基因序列相似度最高，相似度从高到低依次为seq6446、seq6445、seq6440、seq6441、seq6442、seq6448、seq6444、seq6443、seq6447、seq6449和seq6450，因此将该序列归为Dialeuropora的group1。从分子鉴定角度分析，支持石楠大孔粉虱归属大孔粉虱属。

3 结论与讨论

本研究结果显示石楠大孔粉虱前翅肘脉(Cu)存在，中脉(M)消失，成虫翅脉符合粉虱亚科的特征；蛹壳背面在亚缘区分布有蜡腺孔5对，并且都是简单的大孔，而不是复合孔；孔数量、形状、位置以及舌状突无刚毛的特征都与大孔粉虱属相符。从分子鉴定结果分析，其序列长度、遗传距离和系统进化关系均归类为Dialeuropora的group1，支持石楠大孔粉虱归属大孔粉虱属。本研究结果充分印证变更石楠盘粉虱AleurodicusphotinianaYoung分类归属的科学性，确定其归属粉虱亚科Aleyrodinae大孔粉虱属Dialeuropora，种名为Dialeuroporaphotiniana，中文名为石楠大孔粉虱。MARTIN[4]认为，陈连根的描述是确定其分类地位的依据，因此，他认为该种只在中国分布，该种的定名人应为Chen，即该种学名为DialeuroporaphotinianaChen。但杨平澜先生(P. Young)是粉虱分类专家，其鉴定该新种并给予命名(尽管没有发表)的贡献应予肯定，而陈连根对于该种形态特征的详尽描述也对该种的鉴定和鉴别同样重要。因此，本研究支持定名人为2人，沿用学名Dialeuroporaphotiniana(Young et Chen)。