马鞍山地区白山羊线粒体DNA D-loop区和SRY基因的遗传进化分析

杨心春,朱一笑,刘洪瑜,范恒功,周 明,刘旭光

(1 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036；2马鞍山市金农牧业有限公司，安徽 含山 238191)

山羊在我国分布广泛，经历多年的自然选择和人工选择，每个地区逐渐形成了具有不同遗传特点、体型外貌和生产性能的山羊品种。作为一种迁徙率较高的物种，山羊群体的遗传结构和遗传多样性可能会随时间推移发生一定的变化[1]。由于地理隔离和对不同气候的适应，不同山羊种群的结构始终遵循地理分布[2]。动物线粒体DNA(mtDNA)基因组含有D-loop区，作为基因组中进化速率最快、多态性最高的区域，mtDNA受自然选择影响较大，变异程度也较大[3]。mtDNA单倍型、结构和功能的多样性广泛应用在分子进化、系统学、群体遗传分析、个体鉴定、历史起源的鉴定等方面[4]。SRY基因作为哺乳动物雄性Y染色体上的特异性别决定基因，普遍存在于哺乳动物的Y染色体上，其中的HMG-box在研究物种中序列高度保守[5]。曹学涛等[6]在关于绵羊Y染色体特异性引物及SNPs的筛选研究中，证明了6个绵羊Y染色体基因片段与牛、山羊和牦牛具有较高的同源性，说明Y染色体基因具有一定的保守性。Cinar等[7]对土耳其本地山羊品种的研究反映了SRY基因对物种起源的影响。Chen等[8]通过对国内双峰骆驼Y染色体多态性的研究明确了其父系起源和系统发育规律。以往的研究表明，SRY基因在动物的起源、系统发育和群体遗传学方面，基于其高度保守性和遗传进化信息的完整性，作为母系遗传mtDNA遗传标记的重要补充，可以成为了解父系遗传多样性非常理想的标记分子[9-10]。

马鞍山地区白山羊额宽嘴短，纯白色，有鬓，被毛粗、短、直，毛色丝光特征明显，生长速度快，性成熟早，肉质鲜美、营养丰富，深受当地消费者青睐，是十分具有潜力的地方品种资源，但目前关于该山羊种质的相关研究还较为少见，对该白山羊品种资源的保存和开发利用十分不利。为此，本试验采用PCR测序的方法，测定马鞍山地区白山羊SRY基因编码区和mtDNA D-loop区基因全序列，通过测序和分子特征分析，对安徽马鞍山地区白山羊品种内的群体遗传多样性以及与国内部分山羊品种间遗传距离进行分析，以期为马鞍山地区白山羊品种资源的有效保存、开发和遗传改良提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

从安徽马鞍山地区采集品种特征明显、无血缘关系的公羊个体血样19份，母羊个体血样40份，利用含肝素钠抗凝剂的负压采血管，颈静脉采血8 mL于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2 方 法

1.2.1 血液DNA的提取 采用血液基因组DNA提取试剂盒提取马鞍山地区白山羊血液基因组DNA，并采用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA样品。

1.2.2SRY基因和mtDNA D-loop区序列的扩增与测定 根据GenBank中山羊SRY基因序列和线粒体基因组的基因序列设计引物，所用引物信息见表1。

表1 马鞍山白山羊SRY基因序列和mtDNA D-loop区序列扩增所用引物及其信息Table 1 Primers used for amplification of Maanshan white goat SRY gene sequence and mtDNA D-loop region

利用公羊血液提取的DNA进行SRY基因PCR扩增，PCR反应总体系15 μL，其中上、下游引物各0.6 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O补足至15 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 60 s，共32个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

利用母羊血液提取的DNA进行mtDNA D-loop区PCR扩增，PCR反应总体系为15 μL，其中上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O补足至15 μL。PCR反应条件：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃ 90 s，共32个循环;最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小、纯度及亮度，选取扩增效果良好且足量的样品送华大基因公司进行正反双向测序。

1.3 数据处理

使用DNAman软件，对PCR扩增所得的19条SRY基因全序列以及40条mtDNA D-loop区全序列，与从GenBank中下载的20种国内部分山羊品种mtDNA D-loop区全序列(表2)进行编辑整理，用Clustalx 2.0软件进行序列比对；使用DNAsp 5.0[11]软件统计马鞍山地区白山羊SRY基因序列和mtDNA D-loop区序列的多态位点数、核苷酸单倍型数目、单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数，并进行Tajima’s中性显著性检验；基于Kimura2-parameter模型，利用MEGA X软件计算安徽马鞍山地区白山羊与中国部分山羊品种间的遗传距离，并采用邻接法构建系统发育树。

表2 国内部分山羊品种mtDNA D-loop区全序列Table 2 Sequences of mtDNA D-loop sequences of some Chinese goat varieties

2 结果与分析

2.1 马鞍山地区公母羊血样DNA提取

利用血液基因组DNA提取试剂盒提取山羊血液基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果显示提取的DNA质量良好，可以进行下一步试验。

2.2 马鞍山地区白山羊SRY基因和mtDNA D-loop区序列的PCR扩增

利用提取的公母羊血液基因组DNA，PCR扩增公羊SRY基因编码区和母羊mtDNA D-loop区序列，结果如图1和图2所示。由图1和图2可知，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，公羊扩增的目的基因片段长度为800 bp左右，母羊扩增的目的基因片段长度为1 200 bp左右，与预期的片段大小一致。

M.DNA Marker 2000；1～10.SRY基因PCR扩增产物M.DNA Marker 2000；1-10.PCR products of SRY gene图1 马鞍山地区白山羊SRY基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR products of SRY in Maanshan white goat

M.DNA Marker 2000；1～10.D-loop区PCR扩增产物M.DNA Marker 2000；1-10.PCR products of D-loop region图2 马鞍山地区白山羊mtDNA D-loop区的PCR扩增产物Fig.2 PCR products of mtDNA D-loop region in Maanshan white goat

2.3 马鞍山地区白山羊公羊SRY基因编码区的遗传变异

对19头白山羊公羊核苷酸多态性及SRY全序列碱基组成进行分析，结果表明在SRY基因整个编码区共含有92个变异位点，占核苷酸总数的10.50%，其中单一多态位点(singleton variable sites)34个，简约信息位点(parsimony informative sites)58个。A、G、C和T 4种碱基平均含量的占比分别为30.4%，23.2%，23.7%和22.7%，A+T平均含量占比为53.1%，G+C平均含量占比为46.9%，A+T平均含量的占比较G+C高6.2%。

利用DNAsp 5.0软件对白山羊SRY基因的单倍型进行分析，结果(表3)表明，19头公羊个体含有H1～H19共19种单倍型，单倍型多样性(Hd)为1.000，核苷酸多样性(Pi)为0.018 68，平均核苷酸差异数(k)为15.152。

表3 马鞍山地区白山羊SRY基因的单倍型分布Table 3 SRY haplotypes of Maanshan white goat

2.4 马鞍山地区白山羊母羊mtDNA D-loop区的遗传变异

对40头白山羊母羊核苷酸多态性及mtDNA D-loop区序列碱基组成进行分析，结果表明母羊mtDNA D-loop区共含有986个变异位点，占核苷酸总数的69.24%，其中单一多态位点150个，简约信息位点836个。A、G、C和T 4种碱基的平均含量占比分别为31.1%，15.9%，25.1%和27.9%，A+T平均含量的占比为59%，G+C平均含量的占比为41%，A+T平均含量的占比较G+C平均含量的占比高18%。利用DNAsp 5.0对白山羊mt-DNA D-loop区的单倍型进行分析，结果(表4)表明，40头母羊含有H1～H32共32种单倍型，单倍型多样性(Hd)为0.986，核苷酸多样性(Pi)为0.127 13，平均核苷酸差异数(k)为12.915。

表4 马鞍山地区白山羊mtDNA D-loop区的单倍型分布Table 4 mtDNA D-loop haplotypes of Maanshan white goat

2.5 马鞍山地区白山羊与国内部分山羊品种间的系统进化分析

基于Kimura2-parameter模型,利用MEGA X软件计算安徽马鞍山地区白山羊与国内部分山羊品种间的遗传距离，结果表明马鞍山地区白山羊与马头山羊的遗传距离最大，为0.034 1；与辽宁绒山羊的遗传距离最近，为0.000 1。采用邻接法(NJ)构建马鞍山地区白山羊与国内其他20个山羊品种间的系统发育树，结果(图3)表明，马鞍山地区白山羊首先与黄淮山羊、西藏山羊聚为一支，包含3种单倍型；其次与辽宁绒山羊聚为一支，包含7种单倍型；再与贵州白山羊聚为一支，包含5种单倍型；最后与安哥拉山羊、波尔山羊聚为一支，包含7种单倍型。说明马鞍山地区白山羊在起源中受到较多其他羊种群体扩张的影响。

LNG.辽宁绒山羊；HHG.黄淮山羊；YCW.阳城白山羊；AGL.安哥拉山羊；BOER.波尔山羊；GZW.贵州白山羊；SNW.陕南白山羊；BJG.板角山羊；BCW.北川白山羊；CDW.川东白山羊；MTG.马头山羊；HMG.海门山羊；XHG.徐淮山羊;NMG.内蒙古绒山羊；LLYG.龙陵黄山羊；LLG.隆林山羊；TBG.西藏山羊;YLG.云岭山羊；CDMG.成都麻羊；QBMG.黔北麻羊。圈内数字表示遗传距离;圈外数字表示马鞍山地区白山羊羊只编号LNG.Liaoning cashmere goat;HHG.Huanghuai goat;YCW.Yangcheng white goat;AGL.Angora goat;BOER.Boer goat;GZW.Guizhou white goat;SNW.Shaannan white goat;BJG.Banjiao goat;BCW.Beichuan white goat;CDW.Chuandong white goat;MTG.Matou goat;HMG.Haimen goat;XHG.Xuhuai goat;NMG.Inner Monggolia cashmere goat;LLYG.Longling yellow goat；LLG.Longlin goat；TBG.Tibetan goat；YLG.Yunling goat；CDMG.Chendu brown goat；QBMG.Qianbei brown goat.Numbers in circle indicate genetic distance.Numbers outside circle indicate number of Maanshan white goats图3 马鞍山地区白山羊与国内部分山羊品种的系统进化关系Fig.3 Phylogenetic relationship between Maanshan white goats and other goat breeds in China

3 讨 论

单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)是评价群体遗传多样性和分化状况的重要指标，二者数值越大，表明遗传多样性越丰富[12]。本试验中的Hd和Pi数值均较高，说明马鞍山地区白山羊多态程度高，遗传多样性丰富，这与王杰[13]对中国北方11种陇东黑山羊多态信息的单倍型和核苷酸多样度范围的测定结果一致。说明马鞍山地区白山羊拥有较强的遗传选择潜力以及丰富的遗传多样性，在未来的遗传育种工作中应该额外重视。

马鞍山地区白山羊mtDNA D-loop区全序列中A+T的平均含量明显高于G+C，符合mt DNA D-loop区的碱基组成规律，与赵中权等[14]、姜雪鸥等[15]、闫益波等[16]以及Liu等[17]的研究结果一致，说明mtDNA D-loop区全序列均富含A/T碱基，可能是A/T碱基含量越丰富mtDNA D-loop区变异率越高[16]。本研究中，40个母羊个体的mt DNA D-loop区共有150个单一多态位点，具备较高的多态性，在一定程度上支持了张红平等[18]关于4个引进山羊品种mtDNA控制区序列变异和系统发生关系的研究。本研究中公羊SRY基因变异位点只占核苷酸总量的10.50%，占比较少，而4种碱基含量也大致相同，19个公羊样本含有19种单倍型。刘仲娜等[19]关于麦洼牦牛SRY基因序列的分析显示，牦牛的G+C含量为47.6%，且亲缘关系与绵羊和山羊最近。蒋利等[20]在阿勒泰羊和藏绵羊SRY基因序列分析及亲缘关系研究中也发现，A+T含量略微高于G+C，且A、G、C、T 4种碱基含量大致一样。在SRY基因方面，马鞍山地区白山羊与其他品种山羊的系统发育进化关系还需进一步分析。

本研究利用安徽马鞍山地区白山羊与国内部分山羊构建NJ系统发育树，结果显示大部分马鞍山地区白山羊与辽宁绒山羊聚为一支，其余部分分别与黄淮山羊、西藏山羊、贵州白山羊、安哥拉山羊及波尔山羊聚为一支。而且马鞍山地区白山羊与辽宁绒山羊划分为同一个支系，且二者遗传距离最近；与马头山羊遗传距离最远。

mtDNA D-loop区的错配分析常用于检测群体扩张和推断群体扩张时间，Jyotsana等[21]利用错配分析检验了33个印度山羊群体的地理扩张，表明印度山羊群体的扩张模型合理可靠。郝荣超等[22]关于中国南部和西北地区山羊mtDNA D-loop区遗传多样性及群体分化的研究显示，中国南部和西北山羊至少发生过3次群体扩张。Guang等[23]对长江沿岸中国山羊遗传多样性的研究表明，长江沿岸的16个山羊种群具有较高的多样性和聚类性，共鉴定出173种单倍型，其相互间存在遗传物质的交换。Liu等[17]对15个种群藏山羊的错配分析表明，其中的3个单倍群至少有1次群体扩张。Chen等[24]用失配分布和Fu’s Fs统计对中国山羊进行分析，结果表明中国山羊曾发生过群体扩张事件。从本研究构建的NJ系统发育树可以看出，马鞍山地区白山羊中的一部分与西藏山羊处于同一分支，表明二者之间在历史上可能存在遗传物质的交换。白文林[25]利用Fu’s Fs中性检验对中国产绒山羊品种父系与母系起源的分子特征及遗传分化研究表明，中国产绒山羊群体在历史上可能发生过群体扩张事件。

综上可知，马鞍山地区白山羊与辽宁绒山羊遗传距离最近，其次是黄淮山羊、西藏山羊以及贵州白山羊，与马头山羊遗传距离最远。从构建的NJ发育树来看，马鞍山地区白山羊与国内多个山羊品种混合在一起，说明马鞍山地区白山羊在起源中受到较多其他羊种群体扩张的影响。