α-平滑肌肌动蛋白、乏氧诱导因子-1α在肺癌中的表达及对放化疗疗效的影响

刘学武，刘 敏，刘 翼，杨征奇，童月芳

(浙江衢化医院 肿瘤中心，浙江 衢州 324004)

肺癌发病隐匿，发现时疾病分期往往较晚并已扩散至周围组织或转移[1-3]。目前，肺癌主要的治疗方案有放射、手术和药物治疗，但往往因肿瘤易局部复发和远处转移而导致治疗效果欠佳[4-5]。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)广泛参与肿瘤的发生和发展，并与肿瘤放射敏感性相关，已成为肿瘤治疗研究的新方向和新思路。目前关于α-SMA和HIF-1α的报道主要集中在抑制肿瘤生长、纤维化等方面[6-9]。本研究观察α-SMA和HIF-1α在肺癌中的表达及其对放化疗疗效的影响，以期为肺癌患者放化疗提供新的生物靶标。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2017年12月于浙江衢化医院确诊为肺癌的患者66例为肺癌组，同期健康体检者66例为对照组。肺癌组纳入标准：①首次治疗；②明确的组织学病理诊断；③接受放化综合治疗。排除标准：①有放化疗相对禁忌证者；②有严重心、脑、血管、肝、肾疾病史者[10]。肺癌组平均年龄(61.24±5.45)岁，男42例、女24例，病理类型：鳞癌33例、腺癌27例、腺鳞癌6例，组织分化程度：高11例、中21例、低34例，TNM分期：Ⅰ/Ⅱ 22例、Ⅲ/Ⅳ 44例。对照组平均年龄(61.35±5.33)岁，男40例、女26例。两组研究对象性别和平均年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，所选研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 快速总RNA提取试剂盒购自Sigma公司，PrimeScript RT试剂盒和SYBR-Green Premix Ex Taq购自Takara Bio公司，anti-alpha smooth muscle actin antibody 和anti-HIF-1 alpha antibody购自Abcam公司，DAB 染色试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。NanoDrop 2000仪器购自Thermo Scientific公司，PRISM 7900序列检测系统购自Applied Biosystems公司，高通量测序仪购自Life Technologies公司。

1.3 荧光定量 PCR 采用Trizol法提取肺癌组织和癌旁组织中的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，应用SYBR Green实时荧光定量PCR法对miR-21表达进行荧光定量分析。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火90 s、72 ℃延伸90 s，共40个循环。选择β-actin为内参，用2-△△Ct值法计算相对表达量。α-SMA的引物：ForwardAAATGGGACCCTGAACAAACAC，Reverse GGAGCCTGGCAAGCACCTA；HIF-1α的引物：Forward GAAACCACCTATGACCTGC，Reverse CTGTTTGTTGAAGGGAGAA；β-actin的引物：Forward CACACCCGCCACCAGTTCG，Reverse GTCCTTCTGACCCATTCCCACC。

1.4 免疫组化法 将石蜡切片标本在二甲苯中脱蜡处理后，梯度酒精水化。加入蛋白酶修复液，37 ℃孵化30 min。加入3% H2O2，去过氧化物酶封闭液封闭10 min。PBS冲洗后，加入适量山羊血清，室温下封闭30 min。吸取封闭液后，加入一抗于4℃冰箱孵育过夜，再加二抗，室温孵育1 h。PBS冲洗后，DAB显色处理10 min，脱水并封片。

1.5 化放疗方法 肺癌研究对象连续静脉滴注150 mL 0.9%氯化钠溶液(含75 mg/m2多西紫杉醇)3 h。次日采用CT定位肿瘤位置，精确至病灶边缘。将扫描图像传送至三维治疗计划系统内，重建图像。对放射治疗的靶向区进行划分，确定靶区周围的器官组织。在靶向区以外3～4 mm，采用与患者相适应的照射剂量以及照射视野。每周治疗1 次，治疗疗程均为2个月。

1.6 观测指标

1.6.1 疗效 完全缓解：病灶完全消失，并且持续1个月以上无新病灶出现；部分缓解：肿瘤体积消退50%以上，并且持续1个月以上无新病灶出现；病变稳定：肿瘤体积消退25%～50%；病变进展：肿瘤体积增加25%以上，甚至出现新病灶。总有效率=(完全缓解例数+部分缓解例数)/总例数×100%。

1.6.2 毒副反应 记录患者治疗期间恶心呕吐、白细胞下降、血小板下降、贫血、肝功能障碍、肾功能障碍、放射性食管炎、放射性肺炎、肾功能损伤、脱发、电解质紊乱、白细胞减少等不良反应发生情况。

1.6.3 生存率 统计首次确诊至死亡或者截止随访时间的患者例数，随访截止日期为2020年1月13日。

1.7 统计学方法 采用 SPSS22.0统计软件，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，生存资料采用Kaplan Meier法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组织α-SMA 和HIF-1α mRNA 水平 肺癌组织α-SMA mRNA 相对表达量(0.82±0.10)高于癌旁组织(0.38±0.05)和正常组织(0.11±0.02)，肺癌组织HIF-1α mRNA相对表达量(1.27±0.16)高于癌旁组织(0.54±0.09)和正常组织(0.13±0.03)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

**与癌旁组织比较，P<0.01；##与正常组织比较，P<0.01。

2.2 肺癌组织α-SMA和HIF-1α蛋白水平 癌旁组织及正常组织无α-SMA蛋白阳性表达，见封三图1A；肺癌组织中α-SMA阳性表达主要见于胞核内，细胞质中少有分布，主要呈棕黄色弥散分布，见封三图1B。肺癌患者中α-SMA阳性表达为47例(71.21%)。癌旁组织及正常组织无HIF-1α蛋白阳性表达，见封三图1C；肺癌组织中HIF-1α阳性表达主要见于胞核内，细胞质中少有分布，主要呈棕色灶状分布，见封三图1D。肺癌患者中HIF-1α阳性表达为51例(77.27%)。

2.3 α-SMA和HIF-1α水平对放化疗疗效的影响 肺癌患者α-SMA阳性组中放化疗有效率(17.02%，8/47)低于α-SMA阴性组(73.68%，14/19)，肺癌患者HIF-1α阳性组中放化疗有效率(25.49%，13/51)低于HIF-1α阴性组(86.67%，13/15)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 α-SMA 和HIF-1α水平对肺癌患者放化疗疗效的影响 (例)

2.4 α-SMA和HIF-1α水平对放化疗毒副反应的影响 与α-SMA阴性组比较，α-SMA阳性表达主要影响的放化疗毒性指标为恶心呕吐、白细胞下降、放射性食管炎和放射性肺炎(χ2=14.226、14.226、4.881、5.575，均P<0.05)；与 HIF-1α阴性组比较，HIF-1α阳性表达主要影响的放化疗毒性指标为恶心呕吐、白细胞下降、贫血、放射性食管炎和放射性肺炎(χ2=16.752、5.660、6.762、 5.135、 6.106，均P<0.05)。见表2。

表2 α-SMA和HIF-1α水平对肺癌患者放化疗毒副反应的影响(例)

2.5 α-SMA和HIF-1α水平对2年生存率的影响 α-SMA阳性组患者1年生存率为55.32%(26/47)，2年生存率为8.51%(4/47)；α-SMA阴性组患者1年生存率为89.47%(17/19)，2年生存率为52.63%(10/19)；2组患者的2年生存率差异有统计学意义(χ2=15.664，P<0.05)。HIF-1α阳性组患者1年生存率为56.86%(29/51)，2年生存率为7.84%(4/51)；HIF-1α阴性组患者1年生存率为93.33%(14/15)，2年生存率为66.67%(10/15)；2组患者的2年生存率差异有统计学意义(χ2=19.685，P<0.05)。见图3。

3 讨论

有研究[11]认为，氧气对维持肿瘤微环境有重要作用，实体瘤的氧浓度显著低于其他正常组织。HIF-1α作为HIF-1转录因子的主要亚单位，在缺氧条件下能够发挥氧调节功能[12]。本研究结果显示，肺癌组织α-SMA mRNA和HIF-1α mRNA相对表达量明显高于癌旁组织和正常组织，癌旁组织及正常组织无α-SMA蛋白和HIF-1α蛋白阳性表达；肺癌患者中α-SMA阳性表达率为71.21%，HIF-1α阳性表达率为77.27%；表明α-SMA和HIF-1α在实体瘤中均出现高表达，与之前的相关研究[13-14]结果相吻合，提示α-SMA和HIF-1α高表达与肿瘤分化程度和肿瘤治疗效果可能有一定相关性。

董熠等[13]的研究结果显示，α-SMA与不同剂量的放射性有一定关系，在8 Gy照射剂量时，α-SMA水平达到最高，此后逐渐降低；照射剂量增加至12 Gy后，α-SMA水平低于0 Gy照射剂量。魏亚宁等[14]研究结果显示，患者化疗后的HIF-1α表达显著降低。吴旻等[15]研究表明，肿瘤患者放疗后，HIF-1α 表达显著降低。以上研究均表明，放化疗作用肿瘤组织时，对α-SMA及HIF-1α的表达有一定影响。本研究结果还显示，肺癌患者α-SMA阳性组和HIF-1α阳性组的放化疗有效率明显低于α-SMA阴性组和HIF-1α阴性组；与α-SMA阴性组相比较，α-SMA阳性对肺癌患者放化疗毒副反应的影响主要表现为恶心呕吐、白细胞下降、放射性食管炎和放射性肺炎；与HIF-1α阴性组相比较，HIF-1α阳性对肺癌患者放化疗毒副反应的影响主要表现为恶心呕吐、白细胞下降、贫血、放射性食管炎和放射性肺炎。α-SMA阳性组患者的2年生存率明显低于α-SMA阴性组患者，HIF-1α阳性组患者的2年生存率明显低于α-SMA阴性组患者。此前相关研究[16-17]有类似结论。

综上所述，肺癌患者中α-SMA、HIF-1α均呈现高阳性率，α-SMA、HIF-1α阳性患者放化疗有效率和2年生存率下降，α-SMA和HIF-1α阳性表达的相关分子机制还需进一步探究。