基于1H-NMR技术的维生素E亚临床缺乏症奶牛血清代谢谱分析

钱伟东，温小庆，张 雪，张翠羽，于泓漪，邵 广，邹云福，张洪友，夏 成*

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.安达市农业农村局，黑龙江 安达 151400；3.绥化市裕达牧业有限公司，黑龙江 绥化 152000；4.安达市澳森牧业有限公司，黑龙江 安达 151400）

泌乳初期的高产奶牛摄入的营养物质多被用来供应泌乳需求，因此奶牛机体本身普遍处于能量负平衡状态，各种微量元素消耗则随之增大[1]。维生素E（VE）参与机体营养调控，在奶牛养殖中扮演重要角色。奶牛在泌乳时，VE 是必需的脂溶性营养物质、主要的抗氧化剂，能缓解细胞氧化应激，对奶牛的繁殖、免疫等都具有重要的作用。

牛场通常会在奶牛日粮中添加VE 以补充VE缺乏，但高产奶牛泌乳早期VE 亚临床缺乏现象仍然普遍。代谢组学可通过定性和定量分析机体内所有代谢物，对研究生物体系整体变化非常有效[2-3]。核磁共振（nuclearmagnetic resonance，NMR）技术应用比较方便，样品不需复杂处理，又不会破坏样品的原有组成，具有无偏向性等优点，是最能反应生物体自身代谢物变化的一项技术[4-5]。本试验采用核磁共振氢谱（1H-NMR）技术结合多元统计分析进行分析，目的是获得与VE 亚临床缺乏关系密切的差异代谢物，探究泌乳早期高产奶牛VE 亚临床缺乏的代谢物变化，为奶牛VE 营养需要和缺乏的新机制以及奶牛VE 亚临床缺乏症的监测与防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与分组

试验在绥化市某集约化牛场进行，随机选取产后30 d内，体况、胎次、年龄相近的健康经产荷斯坦奶牛为试验动物，检测血浆VE 浓度结合血液生化指标及患病信息，确定对照组（VE含量为4 μg·mL-1以上）和VE亚临床缺乏组（VE含量为2～3 μg·mL-1）[6-7]，每组14 头，组内能量代谢、肝功、维生素含量、氧化应激等指标无差异。

从奶牛分娩至产后第30 天，奶牛饲喂TMR 全混合日粮，每天投料3 次。TMR 日粮组成：青贮25.37 kg，水5.47 kg，高产浓缩料4.09 kg，苜蓿2.50 kg，压片玉米2.00 kg，大豆皮1.50 kg，豆粕1.30 kg，籽1.03 kg，燕麦草0.50 kg，糖蜜1.00 kg，玉米3.00 kg，利乳宝1.20 kg。

牛场采用阿菲金管理软件（Afimilk®3.076，以色列）收集试验奶牛的基本信息（年龄、胎次、体况）等。

1.2 主要仪器

全自动生化分析仪（HITACHI 7170）、-80 ℃超低温冰箱（Thermo Scientific）、超速离心机（Thermo Multifuge X3R）、多功能酶标仪（光栅型，Tecan Infinite®200 Pro,M200 PRO,Austria）、低速离心机（型号为TDL80-2B），上海安亭科学仪器公司提供。

1.3 血液样品采集

清晨空腹采集奶牛的尾静脉血液，每头牛采集20 mL，分装在10 mL 肝素钠抗凝管中，在4 ℃条件下3 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行二次离心。将分离的血浆上清液置于1.5 mL 离心管中，再进行5 min 高速（12 000 r·min-1）离心，将上清液置于1.5 mL离心管中，于-80 ℃冻存，待测。

1.4 生化指标检测

能量代谢：β-羟丁酸（BHBA）采用双抗体夹心法测定，游离脂肪酸（NEFA）采用分光光度法测定，血浆中葡萄糖（Glu）采用改良氧化酶法测定。

脂质代谢：采用自动生化分析仪检测总胆固醇（TG，比色法）、高密度脂蛋白（HDL，直接法，即两点终点法）、低密度脂蛋白（LDL，直接法即两点终点法）等生化指标；采用高效液相色谱法检测VE、VA 和VC。自动生化分析仪检测所用试剂盒为上海尔丙生物科技有限公司产品。

氧化应激：生化分析仪分析总超氧化物歧化酶（T-SOD，比色法）、总抗氧化能力（T-AOC，微量法）、丙二醛（MDA，微量法）、过氧化氢酶（CAT，比色法）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，比色法）。

肝功：生化分析仪分析谷草转氨酶（AST，速率法）、白蛋白（ALB，比色法）、谷丙转氨酶（ALT，速率法）。

1.5 1H-NMR 检测

室温下解冻血浆样本200 μL，置于1.5 mLEP管中，并加入400 μL缓冲液（45 mmol·L-1NaH2PO4/K2HPO4，50% D2O，0.9% NaCl；pH 值为 7.4），混匀之后4 ℃下16 099 r·min-1离心10 min，将550 μL上清液转移至5 mm 核磁管待检。使用1H 共振频率599.93 MHz 的超导核磁共振谱仪（Varian Inova 600 MHz Agilent）。

横向弛豫加权试验：用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gil（lCPMG）序列（弛豫延迟2.0 s，采集时间1.5 s，温度25 ℃，谱宽12 000.0 Hz），总回波时间100 ms，累加次数64次。

1.6 1H-NMR图谱数据处理

通过傅立叶变换、基线校正等处理图谱，采用Mestrenova 软件（V9.0.1）。为提高信噪比，谱图乘上增宽因子为1 Hz的指数窗函数进行傅立叶变换。

谱图处理过程相关系数：血液核共振谱图（积分区间0.6～9 ppm，积分间距0.002 ppm，去掉包含残余的水峰及其影响的区域5.601～6.400 ppm）。

1.7 多元统计分析

使用 SIMCA V 15.0 软件（MKS Data Analytics Solutions, Umea, Sweden）对数据进行UV 格式化处理，然后进行自动建模分析。在获得整理好的数据之后，先进行主成分分析（PCA）。PCA可以揭示数据的内部结构，从而更好地解释数据变量关系。能够提供一幅较低维度的图像（二维或三维），仅仅通过少量的主成分即可降低数据的维度。再将所得结果采用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）的统计方法进一步分析，可以更高效地区分组间差异情况。结合这两种方法可提高模型的有效性和解释性，更加完善了分组效果，且代谢物中与分类变量不相关的正交变量被过滤掉（并对非正交变量和正交变量分别分析），进而确保代谢物的组间差异和使试验组的相关程度信息相对可靠[8-9]。

1.8 筛选差异表达代谢物

对得到的积分段所代表的代谢物进行确定不同组间差异性代谢成分（OPLS-DA）。根据皮尔森相关系数确定相关系数（r）。通过数据的回溯转换（每一个变量的标准偏差的平方根值与其Loading值相乘），再比对相应的相关系数临界值，最后得到差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 奶牛基本信息及血液生化指标

VE 亚临床缺乏组奶牛与对照组奶牛相比血浆中 NEFA（P=0.017）和 LDL（P=0.004）水平显著升高，MDA（P=0.01）水平显著降低，T-AOC（P=0）和HDL（P=0.004）的水平显著升高，见表1。

表1 试验牛基本信息及血液生化指标（平均值±标准差）

2.2 血浆1H-NMR谱图

试验奶牛血浆样本具有代表性的1H-NMR图谱见图1。与0.5～6.0 ppm内区域相比，将6.5～9.5 ppm的区域放大了32倍，以便清楚观察。

图1 500 MHz条件下VE缺乏组和对照组组奶牛1H-NMR典型谱图

2.3 PLS-DA和OPLS-DA模型验证结果

PCA 分析结果见图2（A），显示出两组样品存在一定的分离趋势。为更加清楚准确的研究两组奶牛代谢组差异。对数据进行OPLS-DA 分析（使用SIMCA-P+软件对归一化后的数据进行分析），结果见图2（B），VE亚临床缺乏组和对照组奶牛明显分开，说明两组间差异显著。OPLS-DA 模型的置换检验结果见图2（C），R2余Q2均接近1。说明建立的模型符合样本数据的真实情况（原模型可以很好地诠释两组样本间的差异）。

图2 PLS-DA和OPLS-DA 模型验证结果

血浆载荷见图3，能准确描述组间差异代谢物的上调下调情况，预示着VE亚临床缺乏使奶牛体内发生了明显变化。

图3 VE亚临床缺乏组与对照组的OPLS-DA载荷图

2.4 差异代谢物的筛选

通过单变量分析和多元统计分析，最终筛选出差异代谢物25种，见表2。

表2 血浆中差异代谢物一览表

3 讨 论

当前核磁共振技术应用于奶牛体液差异代谢物谱分析十分广泛，但是国内外应用此技术对奶牛VE亚临床缺乏的研究还未见报道。

本试验本着采用成熟的领先技术来解决兽医临床上重点问题的原则，得到了健康奶牛和VE 亚临床缺乏奶牛全景的代谢图谱，力求全面描述发生VE 亚临床缺乏奶牛体内的代谢物变化。试验奶牛血液生化指标结果表明，VE 亚临床缺乏组奶牛血清中NEFA 和BHBA 的浓度均高于对照组，NEFA浓度显著高于对照组；VE亚临床缺乏组血清中T-AOC 浓度极显著低于对照组，MDA 浓度显著高于对照组；VE亚临床缺乏组血清中HDL极显著低于对照组，LDL含量极显著高于对照组。这些结果表明VE 亚临床缺乏组奶牛机体处于能量负平衡状态，机体脂质代谢增强，发生代谢应激。

同样的，基于1H-NMR 技术的VE 亚临床缺乏奶牛血清代谢组学中给出具体脂类、氨基酸或糖类代表性的指标高低变化，也证实了临床生化结果。而且，VE 亚临床缺乏奶牛差异代谢物主要参与的代谢途径：氨酰基-tRNA 的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、氮代谢，糖酵解或糖异生，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢，这些主要的富集通路提示VE 亚临床缺乏对奶牛脂质代谢、氧化应激等方面产生了明显的影响。

磷脂酰胆碱（DLPC）在细胞结构和活性中起重要作用，有助于脂蛋白的合成与分泌及胆固醇溶解在胆汁中[10-11]。DLPC 是VLDL 的主要组成成分，在VLDL的分泌过程中，其生物合成起至关重要的作用，并会增加花生四烯酸和亚油酸的生成[12]。VLDL 主要由肝脏合成，其功能主要是将肝脏中的脂类物质、VE 等运输到血液供组织利用。机体多种器官或组织（肾上腺皮质、卵巢、睾丸及肝脏细胞）细胞表面均有低密度脂蛋白受体（LDLR）。血液中LDL与组织表面的LDLR结合形成复合物，通过胞吞进入细胞释放VE，供细胞利用[13]。

胆碱（ACh）在维护细胞膜信号传导和结构完整性方面至关重要，是维持胆碱能神经正常传递和肝脏脂质转运的重要物质[14]，在体内由丝氨酸和蛋氨酸合成。丙酮和3-羟基丁酸都属于酮体，是脂肪酸在肝脏内正常代谢的中间产物且可通过血脑屏障及肌肉毛细血管壁，是重要的能源，用于肌肉和脑组织代谢[15-16]。VE亚临床缺乏组奶牛磷酸胆碱、LDL、VLDL、胆碱、丙酮、丝氨酸的上调，表明机体脂质代谢和亚油酸合成增加，磷脂酰乙醇胺与磷脂酰胆碱的生物合成过程增强，这说明VE 亚临床缺乏的奶牛存在能量负平衡，体内相应脂质过氧化产物会随着脂质代谢加强而增多，致使机体产生氧化应激，消耗更多VE。

本研究筛选到的差异代谢物中，有11 种氨基酸在VE 亚临床缺乏组与对照组对比均呈上调，差异代谢物富集的氨基酸代谢通路较多。丙酮酸通过转氨基作用，首先生成丙氨酸再转化成亮氨酸和缬氨酸。也可为赖氨酸和异亮氨酸等氨基酸提供部分碳骨架。丙氨酸是由碳水化合物丙酮酸盐转化而成的非必需氨基酸[17]，或由二肽肌肽、鹅肌肽和DNA 分解而来，是肌肉释放的较为重要的氨基酸之一，高度集中在肌肉中，是主要的能量来源[18]。三羧酸循环（TCA）中α-酮戊二酸氨基化后衍生为谷氨酸、赖氨酸和谷氨酰胺。谷氨酰胺可影响肝脏糖异生[19]，通过调节磷酸烯醇丙酮酸的转录水平或活性，进而增强机体的抗氧化性能力[20]。谷氨酰胺是血浆中最丰富的游离氨基酸，是谷胱甘肽和谷氨酸合成的前体物质[21]，谷胱甘肽能够保护细胞免受自由基损伤，是重要的抗氧化剂[22]。谷氨酰胺在VE 缺乏组奶牛体内升高，表明谷胱甘肽和蛋白质分解代谢增强，导致谷胱甘肽合成不足，对机体易造成氧化损伤。肌酐是肌酸和磷酸肌酸的代谢最终产物。亮氨酸和异亮氨酸有助于调节血糖水平、修复肌肉、提高生长激素的含量，帮助燃烧内脏脂肪。磷酸肌酸大多储存在肌组织，是能量储备的重要化合物[23]。本试验中，VE 亚临床缺乏组奶牛血浆中肌酐含量上升，提示VE亚临床缺奶牛可能通过加强磷酸肌酸代谢来缓解自身能量负平衡状态。

4 结 论

通过1H-NMR血浆代谢组学分析以及多元统计分析等后期数据处理分析后，获得了血浆差异代谢物近30种，结果表明，奶牛发生VE亚临床缺乏造成机体代谢的诸多途径均发生了改变，影响的主要代谢通路有：氮代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，D-谷氨酰胺代谢，糖酵解或糖异生，丙酮酸代谢，柠檬酸盐循环（TCA循环）和谷胱甘肽代谢等。表明VE 的缺乏会增强糖异生、糖酵解和各种脂质代谢，提示奶牛泌乳早期容易发生能量负平衡，此时机体为了补充能量，调动其他生糖途径，代偿性增强脂质动员。VE 亚临床缺乏组奶牛伴随着更为严重的代谢应激，机体氧化应激加剧后反过来又会促使VE消耗增加，造成机体能量代谢的恶性循环。