基于高通量测序的土壤细菌组成、丰度及多样性分析

范 娜，彭之东，白文斌

（山西农业大学高粱研究所，高粱遗传与种质创新山西省重点实验室，山西晋中 030600）

0 引言

土壤盐渍化影响农业生产和生态环境，已成为制约农业生产的一个主要因素[1]。全球大约20%的耕地为盐碱地，还有一半的灌溉地正在演化为盐渍地[2]，且呈逐年增长的趋势。盐碱地会影响土壤中微生物群落组成、数量及其分布。盐胁迫降低土壤微生物的活性、微生物碳、氮量，从而导致有机质被微生物分解的能力下降，土壤质量降低必然导致作物出苗、生长及对营养物质的吸收和转运，营养生长和生殖生长受抑制，产量减少甚至绝收。

利用耐盐植物是改良盐碱地的有效方式之一。植物的耐盐性因种类、品种不同而耐盐性有所区别，培育并筛选出耐盐品种、挖掘作物的耐盐特性应用于盐碱地农业生产，可以缓解盐渍化对农业生产的影响[3]。高粱是全球五大作物之一，抗逆性强，是盐碱农田生长的先锋作物、相对高产作物[4]。

山西省太原市清徐县孟封村自然地理条件特殊，盐渍化问题困扰当地农业生产。本研究选用10份不同的高粱亲本材料在盐碱地进行大田鉴选试验，同时采集清徐县盐碱地土壤样品，采用Illumina Miseq高通量测序方法相结合研究盐碱地土壤微生物群落结构变化，旨在为高粱耐盐材料的筛选及耐盐性研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验地基本情况 试验于2017年5月—2019年10月在山西省太原市清徐县孟封村进行。清徐县属暖温带大陆性气候，年平均日照为2577.5 h，年平均气温为9.6～10.2℃，年均降水量为462 mm。土壤基础理化性状：pH 7.89、EC值1214.10 mS/cm、有机质10.04 g/kg、全氮0.07 g/kg、速效磷8.60 mg/kg、速效钾172.13 mg/kg。

1.1.2 试验材料 本实验室前期通过室内试验和大田试验从400 份典型材料里筛选出10 份材料，分别为622-2、1012、1090、473、342、68、1187、67、135、366。

1.2 样品采集与分析

1.2.1 土壤理化性状的测定 土壤有机质测定采用重铬酸钾容量法，土壤全氮采用半微量凯氏定氮法，土壤有效磷采用碳酸氢钠浸提、钼锑抗显色分光光度法，土壤速效钾采用醋酸铵提取火焰光度法测定[4]。

1.2.2 样品采集 土样取样深度为0～10 cm，每处取5个土样，4℃下运输至实验室，用于测定其相关理化性质，部分样品经冷冻干燥后保存在-80℃超低温冰箱中用于DNA 提取和后续分子生物学试验，充分混合用于DNA提取和高通量测序[5]。

1.3 高通量测序方法

采用高通量测序平台软件对数据处理、进行OTU聚类分析、3Alpha 多样性分析、物种分类分析和多维度分析：基于OTU聚类分析和物种分类的共有分析。

1.4 种子生长指标

第3天统计发芽势，第6天统计发芽率和相对盐害率，计算公式如(1)～(4)所示。

1.5 数据分析

首先对原始数据进行质量过滤和双端序列的连接，应用软件cutadapt和Usearch对连接上的序列进行过滤和去除嵌合体。然后对得到的优质序列基于97%的相似水平上进行OTU 聚类，并利用Usearch。数据库进行物种注释[6-8]。

2 结果与分析

2.1 材料耐盐测定

2.1.1 种子萌发生长情况 发芽率反映种子发芽的多少。从表1 可以看出：10 份高粱亲本材料发芽率的数值范围为44.1%～93.4%，其中材料473、342、67 发芽指标较高，表现出比较好的生长趋势；材料68、622-2 发芽指标较低。发芽率与材料耐盐性呈正相关。

表1 盐碱对高粱萌发的影响

2.1.2 盐胁迫对高粱苗期生长的影响 由表2 可以看出，473、342 生长速率较快，表现出较强的耐盐性；材料68、622-2 生长指标数值较低。耐盐材料盐害系数低于盐敏材料。

表2 盐胁迫对高粱苗期生长速率的影响

2.2 样品测序

采用Usearch 软件去除预处理后序列中非扩增区域序列，对测序错误进行校正，调用uchime 进行鉴定嵌合体，将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列进行blastn 比对，低于阈值的比对结果认为是靶区域外序列，并剔除掉该部分序列[9]。测序数据处理结果见表3。

表3 样品测序数据处理结果

2.3 盐碱地土壤细菌组成及丰度

OTU (Operational Taxonomic Units)指的是在系统发生学或群体遗传学研究当中，为了便于分析，人为的给每个分类单元设置的同一标志。通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。在OTU聚类结果的基础上，获取OTU聚类中的代表性序列[11]。

由图1 可知，10 个材料共有OTU 数为38 个，QTU总数为2109 个，其中样品342 特有的OTU 数为293个，样品67 特有的OTU 数为133 个，样品322 特有的OTU 数为240 个，样品68 特有的OTU 数为133 个，样品135特有的OTU数为160个，样品1060特有的OTU数为262 个，样品1187 特有的OTU 数为241 个，样品366 特有的OTU 数为255 个，样品473 特有的OTU 数为137 个，样品1012 特有的OTU 数为255 个。耐盐材料OTU数量较多，表明土壤中微生物的群体数量与作物生长速率呈正相关。

图1 基于OTU丰度的样本聚类图

2.4 多样性指数分析

丰富度指数（Chao1 指数）高低代表群落或生境中物种数目和复杂度[12]。优势度指数（Simpson 指数）表示一个群落或生境中优势种的地位和作用，值越高说明群落内物种数量分布越不均匀，优势种的地位越突出；多样性指数（Shannon 指数）与群落多样性指数成反比[13]。

土壤细菌的数量大，个体小，代谢强繁殖快，是土壤微生物的主要组成部分，占土壤微生物总数的70%～90%，它能分解土壤中各种有机质，由表4 可知，样品342、473 的Chao1、ACE 和Shannon 指 数 均 最 高，Simpson指数最小，该材料的物种多样性最高；相反盐敏材料68、622 的Chao1、ACE 和Shan⁃non 指数均最低，Simpson指数最大，多样性最低。耐盐材料土壤中细菌种类数量多，土壤微生物的群体数量，微生物数量的增加及其生长速率的增大可有效地促进土壤酶的活性，为微生物的生长提供了较多更易利用的碳源、氮源等营养物质。

表4 Alpha多样性指数统计

2.5 主成分分析

采用PCA 主成分分析，结果表明：主成分1(PCA1)、主成分2(PCA2)和主成分3(PCA3)样品差异性贡献率分别达到42.0%、25.0%和19.0%，三者合计达到86.0%，是差异的主要来源。由图2 可知，1090 和1187 位于PC1 负值区、PC2 和PC3 的正值；1012 位于PC1 的负值区域，PC2 的正值区域及PC3 的正负两侧。622位于PC1的负值区域，PC2的正值区域及PC3的负区域，其余的位于PC1、PC2 的负值区域，PC3 的正值区域。说明样品间的主成分变异显著。

图2 主成分分析

3 结论与讨论

土壤微生物群落在物质循环、腐殖质分解、化学元素转化和土壤质地改良等方面起着重要作用，其丰富度和多样性是维持作物生长、发育的前提条件。盐胁迫影响土壤微生物群落组成、数量及其分布，使微生物对土壤养分的分解作用下降[20]。

本实验采用高通量测序技术对其细菌群落组成进行初步分析。在97%的相似度水平上，10个材料共有OTU 数为38 个，其中样品342 特有的OTU 数最多为293 个，样品,68特有的OTU 数最少为133 个。其中变形菌门为第一优势菌群。这与李新等对内蒙古河套灌区不同盐碱程度的土壤细菌研究结果一致、本研究中10个样品共同的优势菌属为鞘氨醇单胞菌属，说明其分布广泛。此类菌属具有耐盐特性，群落中各物种具有越大的均匀度则群落具有越大的多样性。