类器官培养在癌症中的应用及展望

谢雨欣，许峰晟，王 彤，杨春宇，周雪冰，任香善

(延边大学 1. 医学院、2. 肿瘤研究中心、3. 国家民委重点实验室/吉林省科技厅重点实验室，吉林 延吉 133002)

类器官是由干细胞驱动而以自我组装的方式构建形成的3D细胞复合体，能够模拟人体器官的结构和功能[1]。类器官的3D培养是指将分离出的干细胞植入含多种生长因子的基质胶中，在一定体外条件下诱导培养，形成的包含不同组织来源的上皮细胞结构、能够不断自我增殖及分化、与目的器官功能相类似的3D细胞复合体。类器官根据来源可分为3种：胚胎干细胞和多能干细胞等衍生的类器官、组织来源干细胞衍生的类器官以及肿瘤患者来源的病变干细胞衍生的类器官。

自2014年Lancaster和Knoblich首次系统地提出类器官的概念[2]以来，类器官技术有了长足的进步。研究者们根据不同组织来源的类器官制定最适合其生长的培养体系，并将其在体外长期培养，保存了其来源患者的组织学特征及基因组特性。目前，类器官模型主要应用于肿瘤发生机制的研究、分子标志物的筛选及各类药物的毒性检测、药效评价、新药筛选、建立临床前模型、精准医疗、研究组织器官发育及组织器官的移植和修复等领域(Fig 1)。该文将对类器官模型在肿瘤治疗中的研究现状、应用及前景进行综述。

1 类器官技术在肿瘤中的研究现状

从2009年Sato等[3]成功进行肠类器官的长期培养后，类器官的研究开始逐渐发展，但由于缺乏有效的培养体系，其临床应用受到了极大限制。类器官培养基的成分可分为一般成分和特殊成分。目前，类器官培养基的一般成分[4]主要包括基础培养基成分、B27(一种可以代替血清的培养基补充剂)、氨基酸类、抗坏血酸等。不同类器官所需特殊成分不尽相同，如Wnt-3A常被加入中枢神经系统的培养基中，R-spondin-1(一种可增强β-catenin依赖型Wnt信号转导的细胞外蛋白)在乳腺、小肠、肝脏类器官的发育生长过程中起支持作用，表皮细胞生长因子(epidermal growth factor，EGF)则可在肠类器官中发挥重要作用。由于肿瘤组织中存在被异常激活的促增殖信号通路或与该通路相关的生长因子，这些信号通路或生长因子并非培养基的必要成分，它们的存在反而影响肿瘤的生长分化。因此，针对这种特殊肿瘤类器官制定选择性培养基至关重要[5]。如某些结直肠癌中，Wnt信号通路常被特异激活，在该类培养基中可去除Wnt和R-spondin-1；同样，对于存在EGF受体通路突变的结直肠癌，可去除EGF。通过建立不同类型的培养基，能够构建出相应突变类型的癌症类器官。通过这种方法培养出来的类器官既保留了原肿瘤的组织病理学特征以及基因组稳定性[6]，可用于肿瘤的基础研究及转化医学研究。相比于肠癌类器官，胃癌类器官的研究起步较晚但进展迅速。美国学者利用胃类器官阐明了幽门螺杆菌感染诱发胃癌的机制；日本学者在短时间内建立了67例胃癌生物库并深度探索了胃癌的形态学、基因组学、功能学及胃癌发生发展的机制；Yan等[7]建立了来自34位患者的原发性胃癌类器官生物库，经长期培养发现其基因组图谱仍与体内肿瘤极为相似。而由于肝细胞的多样性和功能的复杂性，肝脏肿瘤类器官的研究仍不够充分。2017年，Broutier等[8]将3种不同亚型的原发性肝癌，包括肝细胞癌、胆管癌、混合型肝癌进行类器官培养，去除了R-spondin-1，Noggin和Wnt3a，但补充了地塞米松和Rho激酶抑制剂，成功证明了肝癌类器官能够保留原始肿瘤的组织学结构及基因组构成。2015年Boj等[9]建立了胰腺肿瘤类器官，发现一些正常的胰腺组织样本在准备胰岛移植时被预先消化，将消化后的材料植入基质凝胶中优化培养条件，以支持人类正常和恶性胰腺组织的繁殖。国内已有学者通过优化培养基方案，构建了正常胰腺组织以及5种胰腺癌亚型(导管腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、腺泡细胞癌、导管内乳头状黏液性肿瘤)的胰腺类器官库[10]，并证明类器官模型可用于进一步探索新辅助治疗失败患者的治疗方案。

Fig 1 Establishment and application of organoid model

乳腺癌的研究目前基于2D细胞模型和动物模型，但物种差异与组织差异限制了乳腺癌的研究。Sachs等[11]已开发出优化的乳腺癌类器官培养条件，在体外培养条件中新增加neuregulin 1蛋白，解决了人源肿瘤异种移植模型培养效果差及无法在体外长期培养的问题。同样地，Djomehri等[12]也针对培养基提出了优化条件，他们假设支架材料本身可能通过机械约束和/或限制关键营养素的供应来限制类器官的生长，因此他们建立了无支架的3D乳腺类器官模型以供研究。实验证明，无支架的3D乳腺类器官模型具有高度一致性和可重复性的优势，能够依靠生物打印标准化3D培养物的分析，不仅可用于研究肿瘤微环境对乳腺癌发生的影响，还可用于使用患者衍生的肿瘤标本的实验中，以促进大规模药物筛选和患者类器官生物库的研究。同样，卵巢癌也是女性的恶性肿瘤之一。最近，两个独立的科研团队报告成功建立了卵巢癌类器官模型。这些癌症类器官能显示出原有病变组织的体细胞突变和扩增/缺失[13]以及亲本肿瘤的标志物表达、突变情况等组织学和基因组特征[14]。例如，他们在肿瘤抑制基因CREBBP、FOXO1、PRKAR1A和CHEK2中发现了移码和非同义突变；在肿瘤和相应的类器官中检测到卵巢癌相关基因BRAF和NOTCH1的非移码插入和缺失；粘蛋白16也被发现在类器官中表达，它编码的癌抗原在正常卵巢表面上皮中无法检测到，但能在卵巢癌上皮中表达，因此可在晚期卵巢癌随访中用作生物标志物。此外，类器官因其与原有组织的高度一致性对化疗显示出肿瘤特异性和敏感性，为卵巢癌药物筛选和治疗提供可靠临床前工具和研究平台。

除了上述消化系统、生殖系统来源的类器官之外，其他系统来源的类器官研究也在逐步开展。目前肺癌类器官体外培养的干细胞主要来源于肺癌患者，研究者通过3D培养建立了能够更广泛地用于临床前研究的5种肺癌亚型[15]，包括腺癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌和小细胞癌的类器官模型[16]。这些模型的建立可预测患者对药物的反应及肺癌个性化药物的开发。研究者建立的前列腺癌类器官模型在体外传代后，与肿瘤具有相同的体细胞突变以及相似的转录组。实验发现[17]，突变的FOXA1能够抑制雄激素信号传导并促进肿瘤生长，这一新机制的发现为将来的研究确定了优先方向。Mullenders等[18]调整出不同培养基条件，建立了膀胱癌基底细胞类器官。实验发现，FGFR3突变的细胞在不添加任何生长因子的培养基中可长时间增殖；同时，成纤维细胞生长因子7/10可促进膀胱癌类器官生长。他们成功培养了超过30个传代的多个类器官系，为膀胱癌类器官生物库的建立及治疗膀胱癌的药物筛查提供了可能性。

2 类器官模型在肿瘤研究中的应用

2.1 类器官模型在病理研究中的应用类器官模型可用于特定肿瘤表达的分子标志物筛选、癌症病人分级分期、预后的推测以及治疗方案的制定。Gendoo等[19]建立了患者来源的胰腺导管腺癌异种移植模型和类器官模型，并对其进行全基因组测序，证实了类器官模型可用于分子标志物筛查及患者预后的判定。Saito等[20]也建立了人肝内胆管癌、胆囊癌和Vater壶腹神经内分泌癌类器官，确定SOX2、KLK6和CPB2可作为胆管癌患者的预后生物标志物。针对不同肿瘤所表达的不同分子标志物，分离患者肿瘤细胞进行类器官培养，能够判断癌症病人分级分期且筛选出最适合的治疗药物。同时，类器官模型具有实时观测并修改治疗方案的优势，针对长期使用某种药物而产生耐药性的情况也能实时进行药物优化。

2.2 药物筛选、新药开发和精准治疗传统的肿瘤药物筛选主要依赖于2D细胞系培养和人源肿瘤异种移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)。2D的细胞系培养操作简便，但来源较为单一，与原有肿瘤表达谱的差异显著且无法长期培养。PDTX来源多样化，与原有肿瘤表达谱的差异小且能够长期培养，但由于建模周期长、费用高、难度大等问题限制了其临床应用。因此，在亟需更加精确的肿瘤药物筛选的情况下，类器官技术的出现解决了这一难题。

“精准治疗”是类器官模型的一大优势。肿瘤类器官在很大程度上保持了原有肿瘤的异质性和生物学特性，因此能够通过体外研究来制定个性化治疗方案。Wetering等[21]已经证明了大肠癌生物库的重要性，该库能够根据患者自身的特异性进行药物筛选，通过患者自身来源的肿瘤类器官培养物，测试各种药物的敏感性和毒性从而获得最适合患者的治疗方法。Broutie等[8]成功证明肝癌类器官能够保留原始肿瘤的组织学结构及基因组构成，并通过类器官技术证明了C19ORF48、UBE2S、DTYMK、C1QBP和STMN1是与原发性肝癌预后不良相关的新基因，但仍需要进一步研究证明其作为预后指标的实用性。该实验进一步增进了对肝癌生物学的了解，并为开发针对该疾病的个性化治疗方法提供依据。根据遗传变化(如EGF受体突变)以及生物标志物(如程序性死亡配体1)的表达，Kim等[15]开发出了肺癌的标准化分子靶向疗法。研究发现的潜在靶点、生物标志物或遗传变化等都有望帮助科研人员开发出新型药物。已有科研人员通过体外类器官实验提出新型联合治疗方案，将类器官技术与靶向治疗相结合，类器官充当活体生物标志物以预测每个患者的治疗反应和耐药性，从而指导“精准治疗”。

2.3 肿瘤发生发展机制的研究类器官的体外培养能够模拟癌症的发生过程，因此可用于对癌症发生机制的研究。李亮等[22]研究发现，体外培养的肠癌类器官多数存在Uhrf2缺失，在含有Uhrf2的肠癌类器官中将Uhrf2敲除，肿瘤干细胞数明显减少，且肿瘤小鼠生存时间延长。其分子机制为Uhrf2与Wnt信号通路下游的重要转录因子T细胞因子4结合，通过抑制T细胞因子4的泛素化降解，最终激活Wnt信号通路下游基因的表达，促进肿瘤的发生发展。因此Uhrf2可视为肿瘤干细胞治疗肠肿瘤的一个靶点。国内已有学者[23]成功建立了腹水来源的胃癌类器官，发现胃癌腹水上清可以激活恶性腹水来源的肿瘤类器官和胃癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，且腹水上清促恶性腹水来源的肿瘤类器官生长与Wnt/β-catenin信号通路激活呈正相关。当Wnt信号存在时，Dishevelled蛋白抑制Axin/APC/GSK-3β复合物使之不能磷酸化降解β-catenin，非磷酸化的β-catenin转运入核调节靶基因的表达。同时根据STAT3的激活可以增加β-catenin在细胞核中的定位，他们推断STAT3信号通路可能与Wnt/β-catenin信号通路在促肿瘤细胞生存和转移过程中起协同作用。通过对胆囊癌类器官的测序结果分析，有学者发现[24]，胆囊癌中高表达的睫状神经营养因子受体通过抑制MAPK/ERK通路的ERK的磷酸化激活，减少基质金属蛋白酶1和10的表达，而基质金属蛋白酶1和10可以促进肿瘤的侵袭转移，因此睫状神经营养因子受体可导致胆囊癌转移受抑制。胰腺肿瘤细胞与胰腺肿瘤相关成纤维细胞的相互作用可以引起肿瘤细胞代谢信号通路的失调，从而促进肿瘤的发生发展[25]。针对胰腺癌类器官的转录组学分析显示[26]，GATA6表达程度与Wnt7B表达程度呈负相关，GATA6可通过影响Wnt7B及其下游信号分子决定胰腺癌类器官对Wnt/R-spondin信号通路的依赖性。

3 类器官模型的优势与不足

类器官模型的优势主要在于其前瞻性、精准性以及高效性。首先，使用类器官作为临床前癌症模型已经成为可能，研究者可以通过类器官技术建立肠癌等类器官模型，指导相应癌症发生机制及治疗方法的研究。其次，类器官模型能够指导癌症的精准治疗并推动下一代研究。肿瘤的精准治疗依赖于对药物敏感性的检测，由于基因突变的普遍性及随机性，患者对药物的敏感性因人而异，传统的药物筛选系统筛选出的药物临床应用价值低且价格昂贵。最后，一种药物的研发周期一般在12年左右，而类器官模型的应用可以大大节省时间和精力。相比2D细胞培养和PDTX，类器官取材灵活，且能够极大地节省建模时间，例如，使用PDTX建立小鼠模型需要6-8个月，而类器官模型只需1个月左右。

类器官技术是一项近几年才发展起来的新兴技术，相比于2D细胞培养模型和PDTX模型具有一定优势，但仍然存在不少问题，主要包括共培养问题、复杂性问题、微环境成分问题以及培养方法问题。第一，肿瘤微环境细胞可与癌细胞共培养但时间有限[27]，如何进行肿瘤微环境与癌细胞的长期共培养成为亟需解决的问题；第二，目前类器官技术难以完全重现机体内部复杂的生理调控过程[27]，如何培养出具有神经系统的形体更大、结构功能更复杂的类器官也是亟待解决的问题；第三，肿瘤微环境的建立依旧不够完善，由于肿瘤微环境会影响肿瘤的进展和转移，类器官模型中缺乏微环境成分可能会导致正常上皮细胞转化失败，因此各类肿瘤类器官体外培养的微环境成分需要一个统一标准；第四，在类器官培养过程中，还可能因实验室培养方法不同(例如生长因子的差异)造成类器官的差异，因此还缺少一个确定的实验室培养方法。

4 总结与展望

类器官模型是当今社会干细胞领域的一项重大突破。对研究者而言，依靠类器官模型可以在体外研究肿瘤发生发展的分子机制，不断发现并验证新的肿瘤靶点，从而为新药开发提供依据，甚至有望在未来通过类器官技术进行药物优化，解决机体的耐药性问题。类器官模型有助于癌症发病的建模以及肿瘤分子表型的确认，以便发现各种器官以及肿瘤谱系的起源肿瘤细胞的生物标志物[28]。对患者而言，癌症综合治疗模式将成为大势所趋，每一位患者都将通过自身来源的肿瘤类器官的体外实验，获得个体化治疗方案。离体生长的人源组织还可以取代器官捐赠的需求，为亟需器官移植的患者提供便利[29]。随着类器官技术的进一步发展，不仅能够建立罕见疾病的体内外模型、实现高通量药物筛选，还能够实时观测人类早期的发展过程[29]，甚至可以与实时成像技术、3D打印技术结合，探索出一种治疗癌症的新方法。