雄激素对肺发育的影响

王邑尘,张进威,刘玲燕,肖苇航,李明洲,李学伟,马继登,*

（1.四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室,中国四川 成都 611130;2.重庆市畜牧科学院,中国重庆 402460）

人胎肺的发育开始于妊娠26 d左右,首先在原始前肠上形成肺芽,而后肺芽不断生长、分支[1],在出生前完成上皮细胞的分化,产生表面活性物质（pulmonary surfactant,PS）。出生后肺泡继续增殖,体积和表面积增加,肺部毛细血管网逐渐成熟[2]。肺的成熟过程受到诸多因素的调节,其中雄激素（androgen）在分支形态发生、PS产生等过程中都发挥重要作用。同时,男性的肺部发育通常较缓于女性。在肺脏中广泛分布的雄激素受体（androgen receptor,AR）[3]为雄激素参与肺部发育提供支持。临床证据显示,2019冠状病毒病（coronavirus disease 2019,COVID-19）[4]、新生儿呼吸窘迫综合征（neonatal respiratory distress syndrome,NRDS）、慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）、哮喘、肺癌等肺部疾病均表现出性别差异。这说明雄激素不仅参与性别分化和维持性征,同时在肺脏的发育和功能完善上也发挥重要作用。研究雄激素对非生殖器官的作用,可进一步丰富性激素的功能,使人们着力探究来源于性器官的睾酮（testosterone,T）等性激素如何以某种方式或途径影响非生殖器官,同时也有助于进一步了解机体发育过程中性腺和肺部的发育情况,探究具有性别差异的肺部疾病如何受到雄激素影响,为疾病的产生及治疗提供理论基础。本文综述了雄激素对肺发育及肺部不同结构的影响,讨论了雄激素对肺功能紊乱的致病机理,这些内容进一步阐释了雄激素对肺部组织的功能作用,可为研究雄激素非生殖相关的作用机制和阐释性别差异疾病提供参考。

1 肺部的发育和功能

肺是动物呼吸系统的重要器官,是与外界进行气体交换的场所。肺组织分实质和间质两部分,实质由肺内支气管的各级分支及其终端的大量肺泡组成,间质由结缔组织及血管、淋巴管和神经等组成。人体肺部的发育始于妊娠4周,持续到成年,可以分为5个阶段,即胚胎期、假腺体期、小管期、囊状期以及肺泡期（表1）。具体来说:胚胎发育至4周左右时,内胚层卷曲形成原始消化管,其腹侧上皮细胞外翻形成原始肺芽,原始肺芽分支到消化管两侧形成两个肺芽,同时上皮细胞进入周围的间充质,在间充质的诱导下开始不断分支,第5周出现段支气管,同时心脏延伸出肺动脉,在肺芽周围形成毛细血管网;第7周结束后,肺部发育成类似管状腺体的形态,即假腺体期,这一时期气管继续分支,同时气管壁细胞分化,形成软骨和支气管平滑肌等结构;16周进入小管期,立方上皮细胞分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞（alveolar typeⅠcell,ATⅠ）和Ⅱ型肺泡上皮细胞（alveolar typeⅡcell,ATⅡ）,ATⅠ细胞变得更薄,与毛细血管共同形成气血屏障,24周时即可检测到PS;30周左右进入囊状期,该时期是肺部发育的重要阶段,PS开始分泌到气管腔内,平滑肌细胞前体开始构建弹性纤维和胶原纤维的纤维网络,为之后的肺泡期做准备;肺泡期是肺部发育的最后阶段,主要对肺泡、肺血管等进行完善,出生时肺部并没有发育完全,大约80%的肺泡都是在出生后发育成的,这一阶段可持续到成年[2,5～8]。

表1 肺的发育阶段[5～6]Table 1 Lung development stages[5～6]

2 雄激素及其受体

2.1 雄激素的产生

雄激素属于类固醇激素,是雄性激素的总称,主要包括T、双氢睾酮（dihydrotestosterone,DHT）等。雄激素在雄性和雌性体内都存在,雄性主要由睾丸分泌,而雌性主要由肾上腺皮质及卵巢分泌[9]。雄激素从胆固醇逐步合成加工而来。胆固醇通过位于线粒体膜中的P450侧链裂解酶转化为孕烯醇酮。孕烯醇酮可以转化为脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone,DHEA）,DHEA经3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD）进一步转化为雄烯二酮或经17β-HSD转化为T[10～11]。T可以经由5α-还原酶转变为DHT,其生物活性比T高[12]。肺中的雄激素来源可大致分为两种,一是来源于循环雄激素,在男性胎肺中第9周就可以观察到来源于睾丸的循环雄激素[13],另外,人胎肺具有通过17β-HSD5的表达从循环前体合成雄激素的能力,同时特定的细胞类型可以通过17β-HSD2的表达促进雄激素的失活[14]。

2.2 雄激素的作用机制

AR属于核受体超家族中的类固醇受体,一般由3个主要功能域组成:N端转录激活区（N terminal domain,NTD）、DNA 结合区（DNA binding domain,DBD）、配体结合区（ligand binding domain,LBD）[15]。在大多数情况下,T及其代谢产物5α-DHT通过与AR结合来触发作用。正常情况下,AR与热休克蛋白（heat shock protein,HSP）形成复合物以无活性形式存在于细胞质中,当T或DHT进入胞质后,AR经历构象变化,从原来的复合物上解离,形成有活性的单体并进入细胞核[16],二聚化后招募共激活因子,结合相应靶基因启动子区域内存在的雄激素响应元件（androgen response element,ARE）,调节靶基因的转录[17]。雄激素调节的靶基因广泛参与多种生理生化过程,如影响肺脏的脂质代谢、细胞增殖[18]和氧的运输[19]等。雄激素除了通过经典的基因组途径发挥功能外,还可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）或与性激素结合球蛋白（sex hormone-binding globulin,SHBG）结合等非基因组途径发挥调控效应[20]。

3 雄激素对肺发育的影响

3.1 支气管树

支气管树是肺部的重要组成部分,为气体交流提供了必要通道。支气管的形成是一个复杂的过程,简单来说,肺芽（肺部）伸长并开始重复分支,向周围的间充质中生长,每个分支都会产生新一代气管[21],从支气管（第1级）至肺泡（24级）,这种分支管道共同构成肺脏的支气管树。整个支气管树的形成依赖于分支形态发生,这一过程涉及上皮-间充质相互作用模式、细胞增殖和分化等重要过程[22]。

3.1.1 支气管上皮

支气管上皮是AR表达的部位之一,在分支形态发生过程中发挥作用[3],为雄激素对支气管树的调控提供基础。分支形态发生主要存在于小鼠的假腺体期（GD 9.5～16.5）[23]。Levesque 等[24]在研究DHT对体外培养胎肺的影响中发现,雄激素可以通过AR途径调控细胞增殖和程序性死亡,进而促进分支形态发生,该团队推测这种机制可能是由于细胞周期调节基因c-Myc受到雄激素调控,但并未对其进行验证;后来Wang等[25]的研究证明,AR可以作用于c-Myc基因的增强子;直到2013年,Ni等[26]在大汗腺癌的研究中阐明了雄激素通过AR影响c-Myc基因的机制,这才为Levesque等的推测提供了理论基础。肺的大多数上皮细胞由上皮祖细胞迅速增殖并分化而来[27],因此保证上皮细胞在合适的时间分化为行使各自功能的细胞群体对于肺部的发展非常重要。这一过程受到诸多因素的调节,例如miR-92a-1-5p。miR-92a-1-5p的作用是保持祖细胞的增殖状态,然而,在GD 17时miR-92a-1-5p被雄激素下调[18],这可能意味着在该关键时间点,雄激素促进上皮细胞由增殖向分化状态转变;与此同时,小鼠肺中的雄激素水平在GD 16左右开始明显升高[28],推测这种抑制效果可能存在剂量效应,即较高水平的雄激素会下调miR-92a-1-5p,从而促进气管结构的发展。当然,这种推测还需进一步验证。此外,成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,FGF）在肺发育的假腺体期也起到至关重要的作用。间质产生的FGF10[29]可以通过上皮成纤维细胞生长因子受体2b（fibroblast growth factor receptor 2b,FGFR2b）发出信号,以促进上皮增殖和分化[30],而FGF10同样受到雄激素的调控[31]。

3.1.2 气道平滑肌

气道平滑肌（airway smooth muscle,ASM）具有调节气道口径的作用[32],同时也参与分支形态的构建[33]。ASM剧烈收缩是哮喘症状的主要表现。近几年关于雄激素对ASM作用的研究越来越多[34～40]（表2）。Kouloumenta等[34]针对兔的研究显示,T可以以非基因组方式松弛乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）或卡巴胆碱（carbamylcholine,CCh）预收缩的ASM,这种作用方式似乎是建立在气道上皮细胞完整的条件下,因为其机械去除气道上皮层可以降低松弛效果。但是,在Bordallo等[35]的研究中上皮移除不会改变牛气管中的雄激素松弛效应,这与Kouloumenta等的结果矛盾,另外,该研究还提出了雄激素通过阻断电压门控的钙通道（voltageoperated Ca2+channel,VOCC）引起ASM松弛的可能性。随后,Montao等[36]慢慢阐明了雄激素对ASM的作用机制,证明了T主要通过阻断PLCβ-IP3信号通路,减少由CCh等激动剂造成的内质网Ca2+的泵出,从而舒张已经收缩的ASM。然而,不同雄激素的作用方式也有差异,5β-DHT对KCl诱导的ASM收缩的抑制比T更强烈[37],其主要通过L型电压门控Ca2+通道来控制胞外Ca2+内流。不同雄激素之间的调控差异可能与其构象有关,5β-DHT特有的构象使其更容易与电压门控通道作用[38]。

表2 雄激素对ASM的影响Table 2 The effects of androgens on ASM

此外,虽然ASM细胞存在AR的表达[41],但雄激素可能主要通过非基因组途径对ASM发挥作用,因为其反应时间通常较短（数秒至数分钟[42]）,不足以让相应的基因转录[43]。但也有研究认为,在哮喘、炎症过程中表达增加的AR可以通过基因组的方式下调Ca2+,从而缓和气道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR）[44]。雄激素是否以不同的方式作用于ASM还有待研究。

3.2 肺泡

肺泡包含两种上皮细胞类型,即Ⅰ型（ATⅠ）和Ⅱ型（ATⅡ）肺泡上皮细胞。ATⅠ细胞形成大部分上皮细胞,主要行使气体交换功能,参与构成气血屏障,但没有增殖能力;ATⅡ细胞仅占外周肺细胞的约15%,可以增殖分化成为ATⅠ细胞,同时具有分泌功能,可以分泌PS以降低肺泡的表面张力,通过防止肺泡塌陷来减少呼吸功[19]。

3.2.1 肺泡发育

PS分泌过程受影响的典型症状是NRDS,该症状有性别差异,多发生在男性早产儿当中。PS主要由磷脂组成,在呼气时起到保持肺泡稳定性的重要功能。PS含有4种蛋白质:SP-A、SP-B、SP-C和SP-D,它们在PS颗粒的适当包装、维持肺泡完整性、肺泡损伤修复[45～46]以及肺的免疫防御系统[47]中起关键作用。ATⅡ细胞的成熟与PS的分泌受成纤维细胞和邻近ATⅡ的细胞间通讯调节[48],各种调节因子刺激ATⅡ细胞成熟并产生PS[49],例如:表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）有利于细胞间的通讯,可以促进胎儿肺ATⅡ细胞成熟[50]。近年来,越来越多的证据表明雄激素参与调控ATⅡ细胞分泌PS的过程。Lee等[48]的研究发现,DHT通过激活SRC增加EGF通路的活性,以促进胎儿ATⅡ细胞成熟。相关研究报道,肺PS中磷脂的合成可能依赖于雄激素的刺激[51]。此外,有研究认为,雄激素可以作用于成纤维细胞,延缓成纤维细胞与ATⅡ细胞间的通讯调节[49];Klein等[52]的研究证明,在胎儿发育过程中雄激素会降低EGF与受体的结合活性;Bresson等[31]发现,雄激素通过Klf5基因影响转化生长因子-β （transforming growth factor-β,TGF-β）途径和PS中板层小体的形成;Bouhaddioui等[18]认为,雄激素可以促进Creb1的表达,并通过miR-130a下调Zeb2的表达,参与ATⅠ、ATⅡ上皮细胞的分化。上述研究结果显示了雄激素对肺泡发育的复杂影响,而非仅局限于促进或抑制。

目前来看,雄激素对肺部发育的影响更像是机体自身的调控现象,因为肺上皮本身也具有产生雄激素的能力,在ATⅡ细胞分化成熟及PS分泌的同时,17β-HSD5[34]、17β-HSD2[53]和雄激素[5]的水平也在上升。有研究人员针对这一现象做出推测:雄激素对ATⅡ细胞的作用是调节其成熟状态的正常生理过程,低水平的雄激素促进肺泡发育,高水平的雄激素则出现抑制效果,17β-HSD5和17β-HSD2在ATⅡ细胞成熟时表达上升是为了控制雄激素水平,而男性的肺相比于女性的肺发育延迟则可能是由于男性除ATⅡ细胞自身来源之外的雄激素[54]。这一推测有别于人们常认为的雄激素在肺泡成熟中的抑制作用,一定范围内的雄激素是否有益于肺泡发育值得进一步探究。

另外,出生于37周前的早产婴儿,通常肺部发育不足[55],提前暴露在O2中可能导致氧化损伤[56],而且还会影响肺泡发育以及免疫系统等[57],这可能会影响ATⅡ细胞的发育,导致PS未产生或量不足时雄激素就已经开始对其进行负调控,这或许可以解释NRDS在男性早产儿中的高发病率。此外,有研究探究了O2和雄激素对肺发育的影响,发现无论高氧（80%）还是正常情况下抗雄激素氟他胺都会阻碍肺部发育,而外源施加DHT会加重高氧对肺部的影响[58],这提示雄激素参与调控高氧对肺部的影响。另有研究报道,降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）在大鼠性器官中显示出雄激素依赖性[59],而CGRP可以降低高氧对肺部的损伤[60],但雄激素是否可以通过CGRP影响肺部高氧损伤还有待验证。

总之,以往普遍认为的雄激素抑制肺泡发育的观点似乎受到了挑战,相反,适量的雄激素可能有助于肺泡发育,当雄激素水平达到一定程度时开始显现抑制肺泡发育的效果,这一观点或许可为NRDS的治疗等提供新的思路,值得进一步探究。

3.2.2 肺泡液体清除

肺泡液体清除（alveolar fluid clearance,AFC）在新生儿适应空气呼吸和消除肺水肿等方面有重要意义,AFC不足也会导致NRDS。该过程由ATⅠ和 AT Ⅱ细胞的 Na+转运驱动[61～62]。Na+先通过位于ATⅠ和ATⅡ细胞顶侧的上皮Na+通道（epithelial sodium channel,ENaC）进入上皮细胞,然后通过基底侧的Na-K-ATP泵进入肺微循环,这种离子转运会产生渗透驱动力,导致流体通过水通道蛋白5（aquaporin 5,AQP5）并沿渗透梯度向下,由肺泡吸收进入间质或血流中[63～64]。

肺泡Na+转运存在性别差异,雄性胎儿的肺泡细胞Na+转运活性通常低于雌性。有研究发现,雄激素可能会导致肺上皮细胞中的ENaC和Na-K-ATP酶亚基表达水平降低,但性别间的差异更多的是源于雌性中雌激素的影响[65]。Haase等[66]的研究证明,DHT会降低肺泡上皮细胞中ENaC和Na-K-ATP酶亚基的mRNA表达,但抑制效果不明显,而T对这一过程无影响。这无法确定雄激素对ENaC的影响。不过,鉴于α-ENaC的启动子序列中确实存在ARE[67],本文作者查阅了在其他组织中的相关研究以提供一些线索:对睾丸切除的大鼠进行T治疗可以增加肾脏中ENaC mRNA的表达,施用氟他胺则会抑制这一过程[68],相反,在雌性大鼠肾脏中DHT会抑制ENaC亚基的表达[69],这些研究结果虽然相矛盾,但至少表明雄激素可以通过AR途径影响ENaC,不同的结果可能源于不同性别之间的差异。目前,关于雄激素对AFC的影响的相关文献不多,两者之间存在怎样的调控仍需进一步探究。

3.3 免疫细胞

肺部行使着与外界进行气体交换的功能,与外界空气接触频繁。空气中含有大量的粉尘、细菌等物质,虽然有鼻腔作为防御外界有害物质的第一道防线,但仍有一些有害物质进入肺部,进而引发哮喘等炎症,所以保证肺部免疫细胞的正常功能尤为重要。关于雄激素如何影响免疫系统的研究颇多,本文仅针对雄激素对肺部免疫的影响,并以哮喘为主线进行概述。

哮喘是气道的慢性疾病,主要表现为支气管免疫细胞高反应性,即气道狭窄、黏液产生过多等[70]。青春期前男性哮喘患病率较高,青春期后降低[71],其后随着年龄的增长发病率再次升高[72]。这可以用体内雄激素含量来解释,青春期后雄激素含量明显上升[73],而随着年龄的增加,生殖机能下降,雄激素水平降低,故哮喘发病率再次提高。而且,雄激素的一些效应机制也支持这一观点,例如:雄激素对ASM的松弛作用可能有助于增加气管通气能力;DHT可以通过AR促进巨噬细胞M2极化[74],降低炎症反应;雄激素在正常状态下会限制骨髓中Ⅱ型固有淋巴细胞（type 2 innate lymphoid cell,ILC2）祖细胞的发育,控制ILC2数量,而在炎症状态下会抑制ILC2产生其他细胞因子[75]（如有产生黏液功能的IL-13[76]、控制嗜酸性粒细胞和肥大细胞活化的IL-5[71]等）,进而缓解哮喘。这体现了雄激素对TH2型哮喘的影响,然而,哮喘是一种复杂的异质性疾病[77],由诸多因素引起,涉及整个呼吸系统,雄激素是否影响其他类型的哮喘以及作用于其他部位（如同样有AR表达的鼻黏膜[78]）还无法确定。鉴于已有实验证明注射T可以缓解患者的哮喘症状,进一步探究雄激素对哮喘的影响机制有助于诞生新的哮喘治疗思路。

4 展望

越来越多的证据表明雄激素对肺的发育及功能有着复杂的影响,而不是人们曾经所认为的减缓肺部发育。雄激素可以通过基因组和非基因组的方式作用于肺,同时,参与细胞生长、凋亡、免疫功能、脂质代谢[79]以及氧气运输、铁离子结合[19]等方面的基因也受到雄激素影响。本文对文献[18]和[31]的研究数据进行了整合（图1）,以期更直观地体现受到雄激素促进（绿色）或抑制（红色）调控的基因,这些受影响的基因或功能在肺中所扮演的角色值得进一步探究。目前,大多数研究着眼于肺中受到雄激素调控的DNA和mRNA,而关于雄激素如何影响lncRNA等其他非编码RNA的研究较少。此外,单细胞测序等新技术在肺部中的应用也越来越多,研究肺部不同细胞间的雄激素差异表达基因可以更为精确地找到雄激素的作用对象。

图1 部分受到雄激素调节的基因（根据文献[18]和[31]整合而成）雄激素直接或通过miRNA间接影响目的基因,绿色:促进;红色:抑制。Fig.1 Partially androgen-regulated genes（based on References[18]and[31]）The target gene is directly affected by androgens or indirectly through miRNA.Green line:Promotion;Red line:Suppression.

性激素之间的相互影响也是值得探究的方面,例如T可在芳香化酶P450的作用下转变为雌二醇[80],这使得雄激素对肺部的影响过程更加复杂。探究不同性别肺部中性激素的作用差异有助于理清性激素与肺部之间的作用网络。

此外,肺部疾病影响着人们的正常生活,相关疾病的治疗方式备受人们关注,而多数对于肺部疾病的研究是在鼠中进行的,猪作为接近人体构造的模式动物,对其进行肺部疾病研究可以在一个更接近人体环境的条件下验证新治疗方法的可能性,提供新的治疗思路。

虽然本文未对肺癌与肺正常组织之间的差异进行概述,但因为人们对癌症的重视,雄激素在肺癌方面的研究众多。例如:在人非小细胞肺癌细胞系中,雄激素可以通过AR途径对一些基因进行调控[81],这说明雄激素对正常肺部和癌症的调节有相似之处。探究雄激素对肺癌的作用以及肺癌与正常组织间的异同或许会在雄激素对肺的影响方面有新的见解。