鲂鲌杂交鱼染色体减数分裂特征及相关基因分析

汤陈宸,吴 昌,李 健,陈 乾,陶 敏,张 纯,覃钦博,罗凯坤,刘少军*

（1.湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室,中国湖南 长沙 410081;2.湖南师范大学生命科学学院多倍体鱼繁殖与育种技术教育部工程研究中心,中国湖南 长沙 410081）

远缘杂交能将不同物种基因组整合到杂交子代中[1]。因此,杂交子代中往往包含了两个及以上的亚基因组,而亚基因组间的相互作用是杂交优势的基础。在植物中,远缘杂交是一种常用的育种方法,如杂交水稻[2]、杂交小麦[3]和杂交菊花[4]等。越来越多的研究表明,很多大自然中现存的植物都来源于物种间的杂交,如花生[5]、棉花[6]等。在高等脊椎动物中,虽然有过一些杂交的报道,但杂交获得两性可育后代的报道甚少。在低等脊椎动物的鱼类中,目前人们已通过基因组数据分析发现并认为,一些自然界的鱼类如红鲫[7]、鲤[8]等为杂交起源的异源多倍体;但是,通过人工的方式进行亚科间、属间、种间远缘杂交,获得两性可育的后代并建立杂交品系的杂交组合相对较少[9]。

减数分裂是有性生殖生物配子产生的必需过程[10]。目前的研究表明,杂交种不育的主要原因在于其减数分裂过程中异源染色体配对和分离发生紊乱。在马（2n=64）和驴（2n=62）的杂交后代骡中,因其63条染色体在减数分裂过程中不能进行正常的联会,所以败育[11];在不育的异源三倍体湘云鲫的减数分裂中,人们同时发现了单价体和二价体的存在,说明同源染色体在配对和分离过程发生紊乱[12];此外,在人工三倍体水晶彩鲫发育阻滞的卵巢中,研究人员也发现减数分裂粗线期的细胞中含有单价体、二价体、三价体和其他多价体[13]。因此,是否能跨越减数分裂阻滞是可育个体形成的重要条件,而杂交物种中来源于不同物种的异源染色体在减数分裂中的相互识别、联会配对和分离尤为困难,更具研究价值。

Dmc1（DNA meiotic recombinase 1）和Rec8（meiotic recombination protein）是减数分裂过程中与同源染色体配对和分离相关的重要蛋白质。Dmc1基因在减数分裂前期Ⅰ特异性表达,其产物Dmc1蛋白和RAD51蛋白共同定位于偶线期,在同源染色体配对过程中起到重要作用[14]。Rec8蛋白作用于染色体的着丝粒,在减数第一次分裂后期,受Sgo1蛋白保护,确保同源染色体分离时姐妹染色单体不分离;在第二次减数分裂时,Rec8蛋白降解,姐妹染色单体顺利分离[15]。在酵母中,Rec8基因作用于减数分裂过程中的染色体配对和姐妹染色单体的凝集[16]。

团头鲂（Megalobrama amblycephala,2n=48）隶属于鲌亚科中的鲂属,而翘嘴鲌（Culter alburnus,2n=48）隶属于鲌亚科中的鲌属。本课题组以团头鲂和翘嘴鲌为亲本,进行属间正反交,获得了两种两性可育的杂交子一代[17],并通过其自交分别建立了鲂鲌杂交品系（BTF1-BTF6）和鲌鲂杂交品系（F1-F3）[18～19]。两性可育杂交子代的形成以及杂交品系的建立在鱼类种质资源创建方面具有重要的意义。本文在鲂鲌杂交品系建立的基础上,以可育的鲂鲌F1为材料,通过对减数分裂过程中染色体特征、相关基因序列和表达水平的研究,初步揭示了异源二倍体杂交鱼可育的细胞学和遗传学机制,在鱼类遗传育种方面具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1均取自湖南师范大学淡水鱼类发育生物学国家重点实验室。由于雌性个体减数分裂的不连续性,即成熟卵子处于减数第二次分裂中期,受精后才刺激第二次减数分裂完成,所以本研究选取雄性鲂鲌F1作为实验材料,进行性腺染色体制备;同时,取同一时期的团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1精巢组织,用液氮将其速冻后超低温保存,作为相关基因检测的材料。

1.2 性腺染色体制备与观察

从雄性鲂鲌F1的腹腔两侧取出精巢组织,放入小培养皿中,小心除去结缔组织,用生理盐水（0.7%的氯化钠）清洗干净;用手术剪将精巢组织剪碎至糊状,随后将其全部转移到15 mL尖底离心管中,用吸管猛吹,打散细胞后补足生理盐水至11 mL;静置10 min后取上清,离心、取沉淀物,加入0.05 mol/L的氯化钾低渗液,低渗处理80 min,其间每隔20 min吸取沉淀物并丢弃,低渗处理结束后离心、收集沉淀物;加入2 mL卡诺氏固定液固定3次,每次固定20 min,固定后离心、取沉淀物,最后加2 mL卡诺氏固定液固定并于4℃保存。吸取20 μL染色体溶液,从高处滴落至冰冻玻片上,于酒精灯上加热、固定,以吉姆萨染液染色50 min后流水冲洗,晾干。最后,在Olympus光学显微镜下观察染色体形态并记录。

1.3 总RNA提取与cDNA第一条链合成

从超低温冰箱取出保存的精巢组织材料,用Trizol（美国ThermoFisher Scientific公司）提取总RNA,具体操作步骤参考试剂说明书。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测新提取的总RNA,确认其是否降解,用酶标仪检测总RNA的纯度和浓度。

检测合格的RNA经DNaseⅠ酶（美国Thermo-Fisher Scientific公司）去除基因组DNA后,用于cDNA第一条链的合成,具体合成步骤参照Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国Thermo-Fisher Scientific公司）的说明进行。

1.4 Dmc1和Rec8基因编码区片段克隆

从NCBI（National Center for Biotechnology Information）公共数据库上查找并下载斑马鱼的Dmc1（NM_001020782）和 Rec8（NM_001040378）基因序列,用BLAST软件从团头鲂和翘嘴鲌的基因组中调取相应的Dmc1和Rec8基因片段。为确保序列的准确性,分别设计引物（表1）,以5条团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1精巢组织的cDNA为模板,用高保真酶（美国ThermoFisher Scientific公司）扩增这两个基因的编码区片段,并完成克隆、测序。

表1 Dmc1和Rec8基因的全长扩增与荧光定量PCR引物Table 1 Primers used for amplification of full-length genes and real-time quantitative PCR

1.5 基因序列比较分析

根据团头鲂、翘嘴鲌与鲂鲌F1的Dmc1和Rec8基因序列,用ClustalW软件分别比对同源序列,分析并计算Dmc1和Rec8的基因序列与氨基酸序列在团头鲂和翘嘴鲌中的同源性;同时分析团头鲂、翘嘴鲌中这两个基因在编码区的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）位点的差异,并进一步利用这些差异的SNP位点,确认鲂鲌F1中这两个基因的遗传组成情况。

1.6 系统进化分析

从NCBI上 下载斑马鱼、鲫、金线 鲃 等鱼类Dmc1和Rec8基因所编码蛋白质的氨基酸序列,将这些序列与团头鲂和翘嘴鲌对应的序列构成单独的文件,利用MEGA 7软件调用ClustalW,进行同源氨基酸多序列比对。采用邻接法（neighborjoining method）构建系统进化树,bootstrap设置为1 000,其他参数选择默认值。

1.7 基因表达检测

以团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1的Dmc1和Rec8基因序列为参考,利用Primer Premier 5软件在三者均保守的编码区域设计定量PCR引物 （表1）。以团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1反转录的cDNA为模板,以管家基因β-Actin作为内参,SYBR GreenⅠ（美国ThermoFisher Scientific公司）为 mix,在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量表达分析。反应条件:50℃5 min;95℃10 min;95℃15 s,61℃45 s,40个循环。实验重复3次,定量结果采用2-△△Ct法,用GraphPad Prism 5软件制图。

2 结果

2.1 性腺染色体减数分裂特征分析

鲂鲌F1作为杂交子一代,其异源染色体组包括一套来源于母本团头鲂的染色体和一套来源于父本翘嘴鲌的染色体。通过对鲂鲌F1精巢染色体制片结果的观察,我们发现部分分裂相中的48条染色体出现了联会配对的现象（图1A）,具体表现为形态大小相近的“同源”染色体两两配对,以24个二价体的形式存在,推测其为减数分裂第一次分裂中期的初级精母细胞染色体。此外,我们也发现少量分裂相仅含有24条染色体,这些染色体均以“X”的形态存在,即每条染色体上均含有一对姐妹染色单体（图1B）,推测此为减数分裂后产生的次级精母细胞染色体。上述结果说明,尽管鲂 鲌 F1中含有两套来源于不同物种的异源染色体组,但其在减数分裂过程中能进行正常的染色体配对和分离,形成染色体数目减半的次级精母细胞。

图1 鲂鲌F1性腺染色体图（A）第一次减数分裂中期初级精母细胞中48条异源染色体配对;（B）第二次减数分裂产生的早期次级精母细胞包含24条“X”形态染色体。标尺:20 μm。Fig.1 Gonadal chromosome distribution in hybrids of M.amblycephala×C.alburnus（A）Forty-eight chromosomes pairing in primary spermatocytes at metaphase of first meiotic division;（B）Twenty-four chromosomes with the morphology of“X”in early secondary spermatocytes produced by the second meiotic division.Bar:20 μm.

2.2 Dmc1和Rec8的序列比较分析

从团头鲂和翘嘴鲌已有的基因组数据中调取Dmc1和Rec8基因。其中,团头鲂和翘嘴鲌的Dmc1基因编码区均为1 029 bp（图2A）,相似性为99.0%,且均编码342个氨基酸（图2C）,氨基酸序列的相似性为99.4%;Rec8基因的编码区均为1 713 bp（图2B）,相似性为98.5%,均编码570个氨基酸（图2D）,氨基酸序列的相似性为97.8%。这两个基因在两个物种中的相似性极高,但存在明显的SNP位点差异,故利用这些差异的SNP位点对杂交子代进行基因的遗传分析。

图2 团头鲂与翘嘴鲌中Dmc1和Rec8基因的核苷酸及所编码蛋白质的多序列比对结果（A）Dmc1基因的编码区序列比对;（B）Rec8基因的编码区序列比对;（C）Dmc1基因所编码蛋白质的多序列比对;（D）Rec8基因所编码蛋白质的多序列比对。Fig.2 The nucleotide and amino acid sequence alignment of Dmc1 and Rec8 genes in M.amblycephala and C.alburnus（A）The nucleotide sequence alignment of Dmc1 gene;（B）The nucleotide sequence alignment of Rec8 gene;（C）The amino acid sequence alignment of Dmc1;（D）The amino acid sequence alignment of Rec8.

分别从5条鲂鲌F1的cDNA中克隆Dmc1和Rec8基因并测序,结果显示:在测序的Dmc1基因中,50%（14/28）的序列与团头鲂的完全一致,10.71%（3/28）的序列与翘嘴鲌的完全一致,而39.29%（11/28）的序列为重组型序列;在检测的Rec8基因中,50%（11/22）的序列与团头鲂的完全一致,4.54%（1/22）的序列与翘嘴鲌的完全一致,而45.45%（10/22）的序列为重组型序列。上述结果表明,Dmc1和Rec8存在较大程度的基因重组,并且鲂鲌F1中表达的这两个基因在结构上更偏向于其母本团头鲂。

2.3 Dmc1和Rec8的系统进化分析

通过构建进化树,我们分析了团头鲂、翘嘴鲌与其他鱼类的亲缘关系。结果如图3所示,在Dmc1和Rec8基因构建的进化树中,所有的鲤科鱼类聚为一支（橙色方框）,其亲缘关系远高于其他鱼类;此外,在鲤科鱼类中,团头鲂和翘嘴鲌单独聚为一支（红色方框）,其亲缘关系高于其他鲤科鱼类,推测其杂交子代可育与其亲缘关系相近有关。

图3 Dmc1和Rec8基因的系统进化分析（A）Dmc1基因的进化分析;（B）Rec8基因的进化分析。橙色方框表示鲤科鱼类,红色方框表示团头鲂和翘嘴鲌聚为一支,亲缘关系较近。Fig.3 The phylogenetic analysis of Dmc1 and Rec8 genes（A）The phylogenetic analysis of Dmc1 gene;（B）The phylogenetic analysis of Rec8 gene.The orange boxes highlight cyprinid fish,and red boxes show that the relationship between M.amblycephala and C.alburnus is closer.

2.4 Dmc1和Rec8的基因表达分析

团头鲂、翘嘴鲌及鲂鲌F1中Dmc1和Rec8基因的荧光定量检测结果如图4所示,两个基因均正常表达。在Dmc1表达上,鲂鲌F1的表达水平略低于团头鲂和翘嘴鲌,但无显著性差异（P>0.05）;在Rec8表达上,鲂鲌F1与团头鲂之间存在显著性差异（P<0.05）,但与翘嘴鲌无显著性差异,且鲂鲌F1的表达水平介于团头鲂和翘嘴鲌之间。这些结果说明,鲂鲌F1中Dmc1和Rec8基因的正常表达可能是保证其正常进行减数分裂的重要原因。

图4 Dmc1和Rec8基因在团头鲂、翘嘴鲌和鲂鲌F1精巢的表达ns表示无显著性差异（P>0.05）;**表示有显著性差异（P<0.05）。Fig.4 The expression of Dmc1和Rec8 genes in the testis of M.amblycephala,C.alburnus and their hybrid fish（BTF1）ns represents no significant difference between BTF1and its parents（P>0.05）;**represents significant difference between BTF1 and its parents（P<0.05）.

3 讨论

生殖隔离提出,不同物种间杂交难以获得存活后代或获得的杂交后代不可育,如在高等动物中杂种雄性不育是普遍存在的现象[9];而在低等动物中,已有研究证明许多物种都是起源于自然杂交事件[20]。自然界中已有记载的鱼类超过32 500种,是脊椎动物中最多的一类[21]。最近的研究表明,很多鱼类是通过自然杂交形成的,如:红鲫[7]和鲤[8]的基因组解析证明,两者均为包含多套亚基因组的异源多倍体鱼,这间接证明了其杂交起源。繁多的种类加上独特的体外受精方式,使得鱼类杂交实验广泛进行。在众多的远缘杂交组合中,目前人们仅发现少数两性可育的杂交种[22]。两性可育的杂交物种是杂交优势在育种工作中延续的关键,也是杂交品系建立的关键。本课题组利用雌性团头鲂与雄性翘嘴鲌的属间杂交,获得了两性可育的鲂鲌杂交鱼子一代,并通过其连续自交建立了鲂鲌杂交品系（BTF1-BTF6）,打破了远缘杂交的生殖障碍,也为探索远缘杂交的遗传和繁殖规律提供了宝贵的研究材料。

目前已有的报道大多是研究杂交种的不育性[23],而杂交种为什么可育的科学问题被研究的相对较少,这可能在于很难获得可育的杂交种材料。本文对鲂鲌F1杂交鱼的减数分裂进行了初步研究。在细胞学方面,制备了鲂鲌F1的精巢染色体,观察到减数第一次分裂中期存在“同源”染色体配对现象,具体表现为来源于团头鲂和翘嘴鲌的两套异源染色体形成了24个二价体的形式;同时也观察到了第一次减数分裂形成的次级精母细胞的染色体,具体表现为24个“X”形态染色体。实际上,减数分裂过程正常进行的关键在于第一次减数分裂过程中的同源染色体联会配对与分离。本研究结果证明了鲂鲌杂交鱼能进行正常的第一次减数分裂,并形成次级精母细胞。张纯等[12]在异源四倍体鲫鲤中发现,异源四倍体的染色体在减数分裂过程中是以100个二价体的形式存在,而不是以25个四价体的形式存在,且未观察到单价体或多价体的存在;而在三倍体湘云鲫中,除了二价体,未配对的单价体也有存在,因此联会紊乱可能是三倍体不育的重要原因。我们推测,鲂鲌F1中两套“同源”染色体在减数分裂过程中能进行正常的联会配对和分离可能是该杂交鱼可育的原因之一。

为研究鲂鲌杂交鱼在减数分裂中“同源”染色体能正常进行联会配对和分离的相关机制,我们对与减数分裂有关的Dmc1和Rec8基因进行了相关研究。虽然这两个基因是在酵母中发现的,但目前的报道已确认其在鱼类的减数分裂过程中也起到重要的作用[24～26]。本文对Dmc1和Rec8的结构、系统进化及表达水平进行了分析。结果显示,在团头鲂和翘嘴鲌之间,这两个基因的序列相似性极高,两者的亲缘关系最近,并且杂交鱼中的基因表达未见异常,推测鲂鲌杂交鱼可育的主要原因是其能够顺利地进行减数分裂过程,即能进行正常的减数分裂调控。根据以上结果,我们推测团头鲂和翘嘴鲌的杂交后代可育是由于其关键基因间具有高度的相似性。在减数分裂过程中,那些差异的SNP位点不影响基因的正常表达和蛋白质的相互识别与作用,异源基因之间可能能够互相调控,从而共同推进减数分裂的进程。

综上所述,本研究制备了异源二倍体杂交鲂鲌F1的性腺染色体,观察到明显的异源染色体配对形成二价体,并分离形成含有单价体的次级精母细胞,直接证明了异源二倍体杂交鲂鲌能够进行正常的“同源”染色体配对和分离,这可能是鲂鲌杂交鱼能够进行正常减数分裂的原因之一。此外,本文对在减数分裂过程中起重要作用的Dmc1和Rec8基因的序列、表达及系统进化进行了分析,揭示了其在团头鲂和翘嘴鲌这两个物种中具有极高的相似性,这可能是鲂鲌杂交鱼能够进行正常减数分裂的另一个重要原因。总的来讲,本文初步探讨了鲂鲌杂交鱼染色体减数分裂过程的特征及相关基因的表达情况,为揭示杂交品系形成乃至杂交物种形成提供了重要的证据,同时也将为杂交育种工作提供重要的理论指导。