中国红树类海桑属植物DNA条形码研究＊

孙稚颖，李强，田晓萌，郭庆梅，邵长伦

（1.山东中医药大学药学院济南250355；2.福建中医药大学药学院福州350122；3.中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室/医药学院青岛266003）

红树林是海滩上特有的森林类型，通常生长在港湾河口地区的淤泥质滩涂上，为自然分布于亚热带和热带海岸潮间带的木本植物群落，周期性遭受海水浸淹。因长期处于陆地与海洋的动态交界面这样一种特殊的环境中，而形成了在结构和功能上具有海陆两栖的生态特性，在自然生态平衡中具有特殊的作用。据报道，中国红树植物共有38种，其中真红树植物26-27种（含变种），半红树11-12种[1-2]。海桑属植物是真红树植物。在《中国植物志》中[3]，海桑属隶属于海桑科，我国仅分布2种，即海桑Sonneratia caseolaris(L.)Engl.和杯萼海桑S.albaJ.Smith，而后经相关学者研究修订[4]，目前在《中国植物志》英文版（FOC）[5]中，海桑属植物隶属千屈菜科，我国包括6种，即海桑、无瓣海 桑S.apetalaBuch.-Ham.、海 南 海 桑Sonneratia×hainanensisW.C.Ko et al.、杯 萼 海 桑、拟 海 桑Sonneratia×gulngaiN.C.Duke & B.R.Jackes和卵叶海桑（桑海桑）S.ovataBacker，主要分布在海南岛，其中无瓣海桑为引进栽培种，海南海桑为杯萼海桑与卵叶海桑的天然杂交种，而拟海桑为杯萼海桑与海桑的天然杂交种。

关于海桑属植物，我国学者主要从木材结构比较解剖[6]、木材结构及其系统演化意义[7]、叶片的结构及其生态适应[8]、孢粉学[9]、形态解剖学[10]、分子标记[11-12]、遗传多样性[13-14]等方面做了一系列研究，充分表明植物的形态构造是与它所生存的环境相适应的，特殊的环境衍生出一些独特的结构。近些年随着国家提出的“向海洋要药”、“向海洋要健康”思潮的引领，为了更好的开发海洋药用生物资源，有关红树类海桑属植物的化学成分及生物活性[15-17]等方面研究也逐渐增加。

准确的物种鉴定是药用植物资源开发的前提和保障。海桑属植物形态特征随环境变化较大，尤其是叶形，在不同生长环境及不同生长时期，往往表现出不同的形状。海桑属内种间杂交种的出现更增加了物种识别的困难。如果没有长期的野外经验，仅依靠形态特征往往不易识别[11]。DNA条形码概念由加拿大分类学家Paul Hebert于2003年首次提出[18]，随之受到各国科学家的关注，DNA条形码不受生物个体形态特征、个体发育阶段、外界环境等影响，能够对于分类学中难以区分的类群,从基因水平上提供一种分类依据，因此成为近年来广泛应用于动植物分类鉴定研究中的有效手段。关于红树类植物的DNA条形码研究，毛晓萌等[19]在中国植物学会85周年学术年会发表论文摘要对中国红树植物进行了DNA条形码构建，认为rbcL+ITS2是红树植物的条形码的理想标记，而matK和trnH-psbA并不适用于红树植物，同时指出DNA条形码在研究物种间杂交情况也有不可忽视的作用。陈怡君等[20]对6种红树林植物进行了ITS2条形码鉴定，认为ITS2序列可准确有效地鉴别不同红树植物。Wu等[21-22]对中国广东省红树植物进行了DNA条形码研究，认为rbcL和trnH-psbA是进行红树植物物种鉴定的最合适DNA条形码。Saddheet al[23]对印度西海岸果阿地区的14种红树植物进行了DNA条形码研究，验证了matK和rbcL作为DNA条形码的鉴定能力，结果表明二者对除红树属、海桑属以及海榄雌属植物以外的其他红树植物能够很好区分。

目前基于DNA条形码技术，针对我国分布的海桑属所有物种的分子鉴定和亲缘关系探讨尚未见系统报道，本文依据《中华人民共和国药典》2020版（第四部）[24]，并参照前人研究，选用叶绿体psbA-trnH基因间隔区和核ITS2序列为DNA条形码，以采自中国南部的6种红树类海桑属植物为研究对象，对其进行分子鉴定研究，以期为海桑属植物的后续资源开发利用、育种及保护等相关研究提供重要参考依据。

1 材料及方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物样品

海桑属植物来源见表1，均采自我国亚热带及热带红树林保护区，经保护区科研人员准确鉴定后，拍照，单株取样，每种3份，每份来自不同个体，采集幼嫩叶片，变色硅胶快速干燥后保存备用。

表1 材料来源

1.1.2 主要仪器

5424R离心机（德 国Eppendorf公 司）；T100 Themrmal Cycle热循环仪（Bio-rad）；电子天平PL202-L（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；DYY-8C型电泳仪电源（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（BIORAD）；数显恒温水浴锅HH-2（国华电器有限公司）；天宝（Trimble）Juno 3B手持GPS全球定位仪（Trimble导航公司）；佳能相机（80D）；ABI 3730XL测序仪等。

1.1.3 试剂

植物基因组DNA提取试剂盒，TBE缓冲液，DL2000 marker，2×Taq PCR MasterMIX，GeneRed核酸染料均购自天根生物有限公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇、β-巯基乙醇、琼脂糖（分析纯）；ITS2片段（引物1：ITS2F；引物2：ITS3R）；psbA-trnH片段（引物1：psbAF；引物2：trnHR）（引物由上海生物工程有限公司合成）。

1.2 实验方法

1.2.1 植物DNA提取

海桑属植物干燥样品各称取约20 mg，分别进行液氮研磨，利用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生物）提取总DNA，具体方法步骤参见试剂盒说明书。

1.2.2 PCR扩增及产物测序

核序列ITS2和叶绿体序列psbA-trnH扩增、测序正反向引物见表2，PCR反应体积为25 μL，扩增体系和扩增条件参见文献[25-26]。

表2 植物DNA条形码通用引物序列

经电泳检测后的PCR扩增产物，直接送样测序。由上海生工利用ABI3730XI测序仪进行双向测序获得相应序列。

1.2.3 数据处理

测序获得的峰图使用CodonCode Aligner 4.2.1（CodonCode Co.,USA）软件校对拼接，去除引物区。然后将ITS2序列使用基于隐马尔科夫模型的HMMer注释方法去除两端的5.8S和28S区段以获得ITS2间隔区序列，psbA-trnH序列参照GenBank相关物种序列切除两端，获取完整序列。将6种海桑属植物测序获得的两种序列分别利用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）6.0进行碱基序列比对及K2P遗传距离分析，然后利用NJ（邻接）法构建系统聚类树，bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率[27,28]。

2 结果与分析

2.1 序列分析

6种红树类海桑属植物核ITS2序列编号同样品编号（表1）；为便于区分，叶绿体psbA-trnH序列编号在各样品编号前加数字，分别为1HS海桑、2WB无瓣海桑、3HN海南海桑、4BE杯萼海桑、5NH拟海桑、6LY卵叶海桑。

2.1.1 ITS2序列分析

所研究6种海桑属植物ITS2序列长度均为229bp；GC含量在67.7-70.3%之间，各种种内无差异，故序列比对中每种仅列1条代表序列进行种间比较，由图1可见，6种海桑属植物种间具有或多或少的碱基差异。其中海南海桑和杯萼海桑碱基差异很小，仅有2个位点不同，分别为68nt处的一碱基插入缺失，以及227 nt处的C-A颠换；拟海桑与海桑碱基差异也较小，只有3个稳定的变异位点，分别为58 nt处的G-T颠换，77nt处的G-T颠换，以及220nt处的C-G颠换；卵叶海桑与无瓣海桑相比有6个位点的碱基差异。基于K2P双参数模型计算遗传距离，遗传距离最小的是海南海桑与杯萼海桑，为0.004，遗传距离最大的是卵叶海桑和海桑，为0.074。

图1 ITS2序列比对

2.1.2psbA-trnH序列分析

参照GenBank，本研究样品psbA-trnH序列长度为395-406 bp，GC含量在24.7-25.6%之间。经序列比对后长度为406bp，各种种内无差异，种间部分物种存有差异，6种红树类海桑属植物种间的psbA-trnH序列比对见图2。其中海南海桑、拟海桑和杯萼海桑碱基序列完全相同，无瓣海桑与卵叶海桑相比仅有3个位点的碱基差异，分别为271nt处的A-T颠换，337nt处的A-G转换，以及365 nt处的一插入缺失。基于K2P双参数模型计算遗传距离，遗传距离最小的是海南海桑、拟海桑和杯萼海桑，为0.000，遗传距离最大的是卵叶海桑和海桑之间，遗传距离为0.021。

图2 psbA-trnH序列比对

2.2 聚类分析

2.2.1 ITS2聚类树

基于ITS2序列，以6种红树类海桑属植物为样本，利用Mega6.0构建的NJ系统聚类树中显示，卵叶海桑和无瓣海桑聚为一支，海桑和拟海桑、杯萼海桑和海南海桑各聚为一支（图3）。其中海桑与拟海桑之间的自展支持率为97%，杯萼海桑与海南海桑之间的自展支持率为100%。

图3 基于ITS2序列构建的中国6种红树类海桑属植物的邻接（NJ）树

2.2.2psbA-trnH聚类树

基于psbA-trnH序列，利用Mega6.0构建的NJ系统聚类树显示，海桑与其它海桑属植物遗传距离最远，无瓣海桑和卵叶海桑聚为一支，自展支持率为90%，海南海桑、拟海桑和杯萼海桑聚为另一支，自展支持率为87%（图4）。

图4 基于psbA-trnH序列构建的中国6种红树类海桑属植物的邻接（NJ）树

3 讨论

红树植物常年生长在特殊的海陆交汇边缘环境中，由于土壤缺氧严重、日照时间长且紫外线强、盐渍化程度高等特征促使红树植物为适应环境也相应的衍生出一套特殊的生物系统，该特点使红树植物产生了一些不同于陆生植物的特殊产物[16]。本研究对中国所分布的红树类海桑属全部6种植物进行了考察、采集，根据文献记载及走访调查，发现民间有药用记载的海桑属植物主要为海桑和杯萼海桑。其中海桑的果实、叶和花可以作为内科用药，另外果实捣烂成糊状，可治疗扭伤。杯萼海桑的果实榨汁发酵，可用于止溢血[15]。目前，由于人们对海洋药用生物资源的关注，无瓣海桑、卵叶海桑、拟海桑以及海南海桑中的化学成分也陆续被研究和报道。海桑属植物次生代谢产物结构类型丰富多样，主要包含脂肪酸类、酚酸类、黄酮类、萜类、甾醇类、生物碱类化合物等，其中有一部分化合物被发现具有良好的生物活性,如抗氧化、抗肿瘤、抑制病原菌等[16,17]，随着对海桑属植物的广泛深入开发研究，相信该属植物药用价值将会进一步被挖掘。

关于海桑属植物的分子鉴定研究，我国学者曾采用ISSR等分子标记技术进行了相关研究，研究表明，ISSR标记多态性强，具有特异型谱带，能很好地区分海桑属物种[11]，此外，海桑属植物具有较丰富的遗传多样性[13]。而有关红树植物的DNA条形码研究，目前可见报道的仍主要集中于DNA条形码片段的筛选，涉及海桑属植物仅一种或两种[20-23]，毛晓萌等人[19]对中国红树植物DNA条形码构建研究摘要中提到包含我国所有红树植物物种，但未见其针对海桑属植物的DNA条形码鉴定的深入系统阐述与分析。为了更好地开发利用海桑属植物药用资源，本研究运用DNA条形码技术对中国6种红树类海桑属植物的ITS2和psbA-trnH序列进行了测定分析，研究表明，中国6种红树类海桑属植物的ITS2序列长度约为229bp，psbA-trnH序列在395-406bp之间。6种海桑属植物各具有其特有的ITS2序列，因每种种内取样均在一个保护区内，所以种内序列间碱基无差异，而6种海桑属植物彼此间有或多或少的差异，因此可以相互区分开来；除海南海桑、拟海桑和杯萼海桑之外，其余海桑的叶绿体psbAtrnH序列彼此间也有碱基差异，可以相互鉴别。基于ITS2和psbA-trnH序列建立的邻接（NJ）树可以在一定程度上反映各种间的相互关系。如在ITS2的NJ树图中，海南海桑与杯萼海桑亲缘关系很近，而海桑与拟海桑关系也很近。在叶绿体psbA-trnH序列比对中，杯萼海桑、拟海桑、海南海桑具有完全相同的序列，而海南海桑是杯萼海桑和卵叶海桑的自然杂交种，拟海桑是杯萼海桑和海桑的自然杂交种[29]，叶绿体序列是母系遗传，因此推断拟海桑与海南海桑具有相同的母本即杯萼海桑，这一关系在其系统进化树上得以证明。此外，在传统的分类学上，常常依据海桑属植物花瓣的有无将其分为两大类：杯萼海桑、海桑和拟海桑为有花瓣的一类，无瓣海桑、卵叶海桑和海南海桑则属于无花瓣类型，而从本研究则可以推断拟海桑遗传了父本海桑、海南海桑遗传了父本卵叶海桑的表型特征。

DNA条形码是通过使用一段或几段短的、标准DNA片段，对物种进行快速、准确识别和鉴定的技术，目前，已越来越广泛地应用于生物的物种鉴定、分类以及亲缘关系探讨。本研究中DNA条形码核序列ITS2与叶绿体psbA-trnH基因间隔区片段表现了较好的物种鉴定能力，并能在一定程度上揭示出物种间的亲缘关系，适用于中国6种红树类海桑属植物物种鉴定，同时为该属植物的资源开发利用、栽培、保护以及生物多样性研究提供了重要参考资料。