补阳还五汤对急性脑梗死患者血清外泌体lncRNA表达谱的研究＊

陈博威，刘柏炎，2＊＊，黄 昕，易 健，唐荣梅，王小菊

（1.湖南中医药大学第一附属医院 长沙410007；2.益阳医学高等专科学校 益阳413002；3.益阳医学高等专科学校附属医院 益阳413002）

脑梗死是我国常见的致死性疾病，并常遗留神经后遗症，给社会、家庭和个人带来了沉重的负担[1]。目前，针对脑梗死急性期的治疗以静脉溶栓为主[2]，但其适应症狭窄，在临床运用中仍存在诸多限制。补阳还五汤是我国治疗中风的经典名方，既往循证研究表明，补阳还五汤治疗急性脑梗死在疗效与安全性方面有一定的优势[3]。课题组前期研究亦发现，补阳还五汤能通过诱导神经再生[4]，促进血管新生[5]，抑制炎症反应[6]及调控细胞自噬[7]等方式，发挥抗脑缺血损伤的作用。然而以往研究都是针对单一靶点与单一通路，无法系统阐明补阳还五汤治疗急性脑梗死的多靶点效应机制。

哺乳动物中有大约98%的RNA是非翻译的调节性RNA分子，其中长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）占绝大部分。lncRNA因其不被翻译成蛋白质的特点，长期以来一直被认为是“转录噪音”。但随着研究的深入，lncRNA被发现可以通过细胞周期调控、剪接调控、RNA降解、基因印记及染色质重塑等形式，积极参与许多重要的生物过程[8]。此外，目前亦发现大量lncRNA在中枢神经系统中有特异表达，并广泛参与了对大脑发育、神经分化及认知与记忆功能的调控[9]，提示其可能是治疗脑梗死的新靶点。然而，目前lncRNA与急性脑梗死的研究多为基础研究，故仍需在临床背景下深入研究lncRNA在脑梗死发病机制中的作用。外泌体是一类直径约40-100 nm的小囊泡，广泛的存在于血液、唾液等体液中，为细胞间通讯的重要媒介，可保护各类信号分子不被降解[10]。既往研究表明外泌体可通过融合、吞噬等方式携带包括lncRNA等的各类信号分子快速通过血脑屏障，参与神经血管单元的细胞信号传递，在脑梗死后发挥神经保护作用[11]，提示外泌体在急性脑梗死的诊断及治疗过程中具有潜在价值。

目前，基于基因芯片的高通量检测技术能够从整个转录组水平探索疾病的发生、发展，已广泛用于一些疾病基因表达谱分析和寻找特异性分子标志物。但截至目前，还未见补阳还五汤治疗急性脑梗死lncRNA表达谱的研究报道。因此，基于前期研究认识，本研究首次同时从外泌体及lncRNA的角度，采用基因芯片技术分析补阳还五汤对急性脑梗死患者血清外泌体lncRNA表达谱的影响，以期系统阐明补阳还五汤抗脑缺血损伤的机理，并为后续的临床及基础研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

急性脑梗死患者均符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》中的诊断标准[12]：急性起病；局灶性神经功能缺损（一侧面部麻木或肢体无力，语言障碍等），少数为全面神经功能缺损；影像学出现责任病灶或症状/体征持续24 h以上；排除非血性病因；颅脑CT/MRI排除脑出血。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：年龄35岁-80岁；首次发病；发病时间6 h-7天；未能进行静脉溶栓或介入取栓治疗；美国国立卫生研究院卒中量表（national institutes of health stroke scale，NIHSS）评分在7分-10分之间，患者或其家属对本研究的目的知情同意并签署知情同意书。

排除标准：房颤引发的心源性脑栓塞；近1个月内曾服用激素等免疫抑制剂；合并有风湿性心脏病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病及严重各脏器功能不全；近2周内有明确的急性感染迹象；在研究期间自然脱离的病例，使临床资料不全者。

1.3 一般资料

选择2019年8月-10月在益阳医学高等专科学校附属医院、桃江县中医院神经内科住院的急性脑梗死患者6例，按随机数字表法分为观察组和对照组。其中观察组4例患者予以补阳还五汤联合西医基础治疗，对照组2例患者予以单纯西医治疗。两组在年龄、性别构成方面差异均无统计学意义（P>0.05）。本试验方案经益阳医学高等专科学校伦理委员会批准。

1.4 治疗方法

观察组4例患者给予补阳还五汤联合西医基础治疗，对照组2例患者给予单纯西医基础治疗。补阳还五汤由黄芪60 g、赤芍15 g、川芎10 g、当归10 g、地龙10 g、桃仁10 g、红花6 g组成，每天1剂，水煎剂，分两次口服或鼻饲管注入。西医基础治疗方案包括应用阿司匹林（批号20171021德国拜耳医药有限公司）100 mg，1次/天或氯吡格雷（批号20180029赛诺菲（杭州）制药有限公司）75 mg，1次/天；阿托伐他汀钙片（批号20070060辉瑞制药有限公司）20 mg，1次/天；依达拉奉注射液（批号20031342南京先声东元制药有限公司）30 mg，2次/天；营养支持等治疗。对合并糖尿病、高血压者均给予降糖、降压及对症治疗,并详细记录合并治疗的药物。

1.5 检测方法

1.5.1 标本收集

治疗后的第7天清晨空腹抽取10 mL静脉血，使用真空采血管收集标本，4℃1600 rpm离心10 min，离心半径20 cm，借助移液枪小心吸取上层血清，-80℃保存送检。

1.5.2 分离血清外泌体

按操作手册采用外泌体exoRNeasy Serum-Plasma Midi Kit（货号：7704，Qiagen公司，德国）先分离外泌体，然后采用Trizol法提取总RNA，包括mRNA、lncRNA和其他非编码RNA等，经安捷伦2100生物分析仪（安捷伦公司，美国）电泳质检合格后备用。

1.5.3 lncRNA芯片检测

采用SBC Human LncRNA 4x180k芯片（货号：074348，安捷伦公司，美国）按说明书标准操作流程进行，包括RNA荧光标记、标记物芯片杂交、芯片洗涤和扫描等环节。

1.5.4 差异lncRNA数据分析

运用R语言“limma”软件包[13]，将基因芯片扫描得到的原始数据进行归一化处理，随后将归一化数据采用表达差异倍数（log2（FC）的绝对值）小于0.5或大于2.0以及P<0.05对差异表达基因进行筛选。

1.5.5 差异表达lncRNA的富集分析

运用R语言“Biomanager”、“ClusterProfiler”等软件包[14]，将得到的差异lncRNA的顺式（cis）作用靶基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。其中cis作用靶基因指在每个lncRNA上下游10kb范围内，可能受其调控的mRNA[15]。GO富集分析由生物过程，细胞组成和分子功能组成，三个部分各自描述了基因产物可能形式的分子功能，参与的生物过程和所处的细胞环境。KEGG基因富集分析可将已知的基因组注释信息进行分类，对差异显著的信号通路进行富集，有助于找到显著性差异变化的生物学调控通路[16]。

2 结果

2.1 差异lncRNA的散点图与火山图

将原始数据进行归一化处理后，以log2（FC）的绝对值小于0.5或大于2.0，以及P值小于0.05筛选差异表达lncRNA。散点图与火山图见图1A与图1B，从两图可得知两组间有一定量的差异表达lncRNA。图中展示的为未经Flag筛选的所有信号值，故差异基因（红色、蓝色点）的个数会多于差异基因列表。

图1 差异lncRNA的散点图与火山图

2.2 差异lncRNA筛选

对两组之间表达lncRNA以log2（FC）的绝对值小于0.5或大于2.0，以及P值小于0.05筛选差异表达lncRNA，发现两组共有20个差异lncRNA，其中19个下调，1个上调。差异lncRNA热图见图2，详细信息见表1。

表1 两组间差异表达的20个lncRNA

图2 两组间差异lncRNA热图

2.3 差异基因GO功能富集与KEGG通路富集分析

对差异lncRNA的cis作用靶基因进行富集分析。共获得353个GO功能富集分析，其中富集分析前30的结果涉及生物过程19个，主要为RNA代谢过程的调节、细胞组件组装及生物合成过程等；细胞组分7个，主要在细胞核上；分子功能4个，主要为水解酶活性及核酸结合等（图3）。此外共获得18个KEGG通路富集分析，其中富集结果为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、雌激素（Estrogen）信号通路等（图4）。

图3 差异lncRNA的GO功能富集分析

图4 差异lncRNA的KEGG通路富集分析

3 讨论

中医学将脑梗死归纳于“中风”范畴，并认为主要病机为因虚致瘀、脉络瘀滞，气虚血瘀为中风病重要的病理因素[17]。补阳还五汤由清代名医王清任所创，专用于中风病气虚血瘀证的治疗。方中重用黄芪，大补元气使气旺以促血行；臣药当归尾长于活血，且有化瘀而不伤血之妙；佐以川芎、赤芍、桃仁、红花助当归尾活血祛瘀，地龙通经活络，全方共奏益气活血之功。临床研究表明，补阳还五汤能够改善急性脑梗死患者的神经功能，提高患者的日常生活质量[18]。

脑梗死的发病机制十分复杂，其神经损伤为多重因素、多种机制交互作用发生的“瀑布式”病理变化，包括神经细胞能量代谢障碍、神经炎性损伤等[11]。在脑缺血后，如何有效的将药物快速传递通过血脑屏障，对挽救受损脑组织有着重大意义。研究表明，大脑内含有大量外泌体，这些外泌体能够维持大脑神经元正常功能，且在促进大脑内外细胞通讯的过程中有着重要作用[19]。如有研究发现脑缺血后大脑的外泌体浓度会显著上升[20]，并携带神经营养物质快速穿透血脑屏障发挥神经保护作用[21]。此外临床实验亦表明，通过外泌体给药治疗，能够有效促进缺血性脑损伤组织的神经再生和血管生成[22,23]。

外泌体发挥其细胞间通讯功能被认为主要与其所携带的包括lncRNA在内的各类信号因子有关[24]。lncRNA并不能直接翻译蛋白质，但是目前越来越多的研究发现，lncRNA能够通过转录调节和转录后调节等多个方式，参与许多重要的生物过程[25]。如有研究发现lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1,SNHG1）在脑缺血后可通过调控VEGF与HIF-1的表达，促进血管新生，降低脑缺血损伤[26]。另有报道表明lncRNA H19在脑缺血后与TNFα呈正相关，而敲除该基因后会逆转小胶质细胞的活化并降低TNF-α的产生[27]。此外，有研究证实通过沉默lncRNA肺腺癌转移相关转录因子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）会抑制促脑缺血后凋亡因子的生成[28]；但也有研究指出lncRNA MALAT1亦具有调控细胞自噬，减轻神经元死亡的作用[29]。上述研究提示lncRNA可能是发挥抗脑缺血损伤的新靶点。

目前，中医药对lncRNA的研究还相对较少，属于初步探索阶段。既往研究发现白藜芦醇、姜黄素等多种中药活性成分，能够通过调控各类lncRNA，发挥抗癌作用[30]，亦有研究表明中医药能够通过调控lncRNA，发挥促进血管新生，抑制凋亡的作用[31-32]。有学者通过采集缺血性中风急性期患者的血清，筛选出中风病阴阳类证及与正常组对比的lncRNA差异表达谱，并发现急性缺血中风阴阳类证的发生发展与血糖、血脂及同型半胱氨酸的代谢有关[33-34]。脑心通胶囊是治疗脑缺血的有效中成药，通过高通量测序脑心通胶囊肠吸收液对脂多糖诱导的小胶质细胞lncRNA的差异表达，推测脑心通胶囊可能通过调控lncRNA生长停滞特异性转录本5（growth arrest specific transcript 5,Gas5）及其靶向的mRNA抑制炎症反应，发挥抗脑缺血损伤的作用[35-36]。Cui等则发现补阳还五汤可影响脑损伤大鼠脑组织18个lncRNA差异表达，这些lncRNA的生物学机制可能与血红蛋白复合物、氧转运蛋白活性和丙酮酸代谢有关[37]。

本研究是首次同时从外泌体和转录组学的角度探讨了补阳还五汤对急性脑梗死患者血清外泌体lncRNA表达谱的影响。结果表明，两组间共有20个差异表达的lncRNA，其中19个下调，1个上调，差异表达最显著的lncRNA索引号依次为lnc-PARN-12:1、NR_039803及lnc-NDEL1-6:1，目前尚未见上述3个lncRNA的研究报道，有待验证。通过对差异lncRNA的生物信息学分析，发现GO功能富集分析与众多生物过程密切相关，提示补阳还五汤治疗急性脑梗死涉及多重因素多重分子机制。此外，KEGG通路富集分析主要为MAPK信号通路、雌激素信号通路等。MAPK信号通路是大脑缺血缺氧后的重要调控通路，与氧化应激、炎症反应、凋亡及自噬等病理过程密切相关[38]。有实验证实，在脑缺血后活化的MAPK通路会激活Nrf2通路，而中药能够抑制MAPK通路的磷酸化，扭转Nrf2核移位，减少氧化应激[39]；亦有研究发现MAPK信号通路与炎症反应密切相关，其在大脑缺血后可激活下游的NF-κB通路，促进炎症反应[40]，抑制MAPK通路活化则可以减轻炎症反应，具有神经保护作用[41]。前期研究已发现补阳还五汤含药血清能够通过调控MAPK信号通路，对糖氧剥夺模型的星形胶质细胞产生保护作用[42]。雌激素是一组类固醇激素，易于扩散穿过细胞膜，并通过与靶器官中的雌激素受体结合而产生生物学效应。研究发现，大脑中的雌激素并非来自通过血脑屏障循环的雌激素，而是在大脑中合成[43-44]。且有证据表明通过雌激素治疗，能够对脑缺血后卵巢切除的动物产生神经保护作用[45]。此外，课题组前期研究亦已证实补阳还五汤能够通过调控雌激素及其受体的水平，减轻脑缺血损伤[46]。上述研究表明补阳还五汤能够通过多通路、多靶点发挥抗脑缺血损伤的作用，也进一步印证了本研究的准确性。

综上所述，本研究初步发现补阳还五汤会改变急性脑梗死患者的血清外泌体lncRNA表达谱，推测补阳还五汤可能通过调控这些lncRNA的表达水平，发挥抗脑缺血损伤的作用。这些lncRNA涉及诸多生物过程和信号通路，为后续的临床及基础研究提供了新思路。但由于基因芯片高昂的价格，本研究只纳入了少量病例，今后课题组将做进一步的研究。