藏药十二味翼首散治疗“年仍奈”潜在机制的网络药理学研究＊

张丰荣，黎彩凤，祝娜，张晓瑞，崔建枝，葛莎莎，王均琪，沙子珺，张方博，唐仕欢，黄秀兰，李志勇，＊＊

（1.山东中医药大学中医学院济南250300；2.中央民族大学药学院北京100081；3.江西中医药大学院士工作站南昌330004；4.山西中医药大学基础医学院太原030600；5.中国中医科学院医学实验中心北京100700；6.中国中医科学院中药研究所北京100700）

藏医学是祖国传统医学的重要组成部分，现存最早的藏医典籍《月王药诊》中已存在瘟病及疫病等概念，藏医《四部医典》将传染性、流行性疾病称为“年仍奈”[1]，“年仍奈”即“疫病”，属于热病范畴，藏医主要采取祛邪和扶正的治疗方式，逐渐战胜病邪，恢复人体正气，最终使热病治愈，如《甘露宝瓶》所载：“初期治‘年’病、中期清热证、后期治‘隆’强体质”为治疗原则，结合“三因制宜”以辨证施治[2]。藏族成药十二味翼首草散具有消除瘟热的作用，主治瘟病、时疫等症，现代主要应用于瘟疫、流行性感冒、乙型脑炎痢疾、热病发烧等疾病。2月23日，西藏自治区藏医药管理局印发《新型冠状病毒感染肺炎藏医药防治方案（试行第二版）》提出在藏医药理论指导下的新冠肺炎预防和治疗措施，十二味翼首草散被《方案》推荐用于防治新冠肺炎[3]。

细胞因子风暴（cytokine storm）是指机体感染微生物后引起体液中多种细胞因子如白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、干扰素（IFN）、趋化因子（CXCL8）、集落刺激因子（CSF）和生长因子（EGF、VEGF）等迅速大量产生的现象[4]。甲型H1N1流感[5]、H7N9禽流感[6]、流感后肺炎[7]和埃博拉[8]等疾病均影响体内炎症因子过度表达而出现“细胞因子风暴”。临床一线救治专家发现新型冠状病毒感染患者TNF-α，IL-6，IFN-γ等炎性细胞因子显著升高，具有细胞因子风暴的特征[9]，高细胞因子血症易致炎性物质聚集和渗出，引发多器官衰竭和急性呼吸窘迫，可能是导致新型冠状病毒肺炎（以下简称“新冠肺炎”）重型、危重型患者死亡的重要原因[10]。

本文对藏医“年仍奈”的研究以新冠肺炎为例，《四部医典释难》记载：“疫病是人体俱生微虫与外界‘巴巴达’毒虫相遇，侵入人体七正精和三秽物中引起的一种即刻夺取性命的凶猛疾病”[11]。新冠肺炎以发热、干咳和乏力为主，并伴有流涕、咽痛和肌痛等症，其病位在肺，由人体感受疫戾之气，使正常“肺隆”紊乱失调[12]，其与体内原有生物之间产生相互对抗，导致急性炎症反应，并涉及全身，最终引起所谓的疫病[1]，此过程可能导致体内的细胞因子风暴发生。藏医辨证治疗“年仍奈”通常采取三个阶段，初期主要以“集热平稳”的治疗方法，发病中期以“散热驱邪，抑制传播”为主，后期治疗采取“安抚身心，调养身体，防治并发症”的治法[1]。网络药理学具有整合药理学、系统生物学等多学科配合的优势，适合中药及民族药多成分多靶点多通路的特点，用于系统地研究分子，细胞，组织等治疗复杂疾病的药物的作用机制[13]。本文借助现代网络药理学技术探究十二味翼首散抗细胞因子风暴的潜在机制与防治“年仍奈”的不同阶段相结合，使传统藏医防疫疗法与现代网络靶点之间建立相关联系，为后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 十二味翼首散化学成分和靶点库的构建

检索中药系统药理数据库（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）和化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），收集十二味翼首散中“翼首草”、“角茴香”、“莪大夏”、“麝香”、“檀香”、“红花”、“牛黄”、“安息香”的化学成分。从中国知网和PubMed数据库收集“榜嘎”、“黑草乌叶”、“五灵脂”、“石灰华”的化学成分。根据SWISSADME（http://www.swissadme.ch/）筛选肠吸收（GI）为high[14]，类药性（DL）指标中含有两个或两个以上为YES的化合物[15]，构建十二味翼首散候选活性成分数据库。十二味翼首散的化学成分通过使用PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库对其验证并转化为标准的Canonical SMILES格式，随后导入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）数据库[16]，设置物种属性为“homo sapiens”，收集并构建活性成分的候选靶点库。

1.2 十二味翼首散候选靶点通路注释分析

利用STRING 11.0（https://STRING-db.org）数据库对十二味翼首散的靶点蛋白进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，通过Omicshare（http://www.Omicshare.com/tools/index.php/）数据平台对富集结果进行可视化处理，取P<0.05的前20个结果条目，得到GO及KEGG信号通路气泡图。

1.3 新冠肺炎疾病靶点库及PPI网络的构建

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org）中以“2019-nCoV”、“Novel Coronavirus Pneumonia”为关键词检索新型冠状病毒肺炎的疾病相关基因。将十二味翼首散靶点与新冠肺炎靶点分别导入VENNY在线工具，生成VENN图。基于上述交集分析结果，利用STRING 11.0数据库（https://string-db.org/）和Cytoscape 3.6.0软件中构建十二味翼首散与新冠肺炎的交集靶点相互作用网络（PPI网络），设置Confidence（Score）cutoff值为0.50，根据“Degree”、“ClosenessCentrality”和“BetweennessCentrality”的中位数进行筛选，以大于3倍中位数的靶点筛选为核心靶点，进行可视化展示。

1.4 网络可视化及基因功能富集分析

使用Cytoscape 3.6.0的插件MCODE，设置“Degree Cutoff”值 为2，“Node Score Cutoff”值 为0.2，“K-Core”值为2，“Max.Depth”为100，导入十二味翼首散与新冠肺炎的交集靶点PPI网络，进行聚类分析。将聚类的结果导入ClueGO，选择“Homo Sapiens”，设置P<0.05，进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。通过Cytoscape 3.6.0构建十二味翼首散的“药物-活性成分-靶点-通路-功效”关系网络。

2 结果与分析

2.1 活性成分和靶点库的构建

根据GI和DL筛选后，十二味翼首散共纳入256个潜在活性化合物，其中翼首草含有8个，榜嘎8个，黑草乌叶3个，麝香21个，角茴香8个，莪大夏21个，五灵脂19个，红花72个，檀香41个，牛黄9个，安息香46个。经活性成分收集12347个靶点，删除重复项后，共涉及1066个靶点。十二味翼首散中石灰华经GI和DL指标筛选后无成分纳入，故本文暂时未将其纳入分析范围。安息香和红花的靶点和共有靶点730个，数量最多，提示安息香和红花在组方中可能发挥着不可或缺的重要作用。黑草乌叶和翼首草预测的靶点和共有靶点数量均较少，提示黑草乌叶和翼首草可能不占主导地位，十二味翼首散药物潜在靶点详细见表1。

表1 十二味翼首散药物潜在靶点分析

2.2 候选靶点通路富集分析

基于STRING数据库对十二味翼首散候选靶点进行GO注释结果和KEGG通路富集，其中生物过程获得3247条富集结果，KEGG通路获得228条通路。生物过程（BP）主要富集条目为对刺激的反应（response to stimulus）、细胞对刺激的反应（cellular response to stimulus）、蛋白质磷酸化（protein phosphorylation）、代谢过程（metabolic process）等。另外，KEGG通路主要集中在MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）、cAMP信号通路（cAMP signaling pathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信号通路（Ras signaling pathway）、细胞凋亡（Apoptosis）等。根据P排名前20的功能条目进行可视化分析（图1-图2）。

图1 十二味翼首散候选靶点富集的生物过程（top 20）

图2 十二味翼首散候选靶点富集的KEGG通路（top 20）

2.3 新冠肺炎疾病靶点库及其PPI网络的构建

通过GeneCards数据库收集得到259个新冠肺炎疾病靶点，与十二味翼首散预测靶点取交集，得到重要的81个交集靶点。利用STRING数据库获得交集靶点拓扑数据，再使用Cytoscape构建交集靶点PPI网络，“Analysis”分 析 网络，得到TNF、IL6、GAPDH、TP53、MAPK3、ALB、EGFR7个核心靶点（图3）。

图3 十二味翼首散与新冠肺炎核心靶点网络

2.4 十二味翼首散与新冠肺炎交集靶点网络分析

根据Cytoscape中的插件MCODE分析交集靶点网络分为4大MCODE（子模块），子模块代表不同功能互相关联的蛋白所存在的相互作用而协同完成特定的分子功能[17]。第一大模块涉及30个节点，377条边，第二大模块涉及6个节点，10条边，第三个模块涉及4个节点，5条边，第四个模块涉及3个节点，3条边，见图4。由于十二味翼首散与新冠肺炎的核心靶点均出现在模块1，模块2和4未富集到通路，且模块3的通路与新冠肺炎相关疾病存在较少关联，故详细分析模块1所参与的KEGG通路和GO生物过程功能，其主要涉及3个方面：①参与机体的免疫应答功能和炎症反应，涉及相关通路为TNF信号通路（TNF signaling pathway）、T细胞活化与免疫应答（T cell activation involved in immune response）、急性炎症反应的调节（regulation of acute inflammatory response）、白细胞介素-6的反应（response to interleukin-6）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NFκB信号通路（NF-kappa B signaling pathway）等，②参与血管通透及内皮细胞功能的基本调节通路，主要为VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、白细胞与血管内皮细胞粘附的调节（regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell）、血管内皮生长因子的调节（regulation of vascular endothelial growth factor production）等，③与病毒感染相关功能通路，主要涉及

图4 十二味翼首散与新冠肺炎交集靶点聚类图

朊病毒病（Prion diseases）、人巨细胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）（图5-图6）。

图5 十二味翼首散与新冠肺炎交集靶点子模块1的KEGG通路

图6 十二味翼首散与新冠肺炎交集靶点子模块1的GO生物过程

2.5“药物-活性成分-靶点-通路-功效”关系网络分析

根据“药物-活性成分-靶点-通路-功效”关系网络的构建与分析，涉及11味中药，即翼首草、榜嘎、角茴香、莪大夏、黑草乌叶、牛黄、麝香、安息香、五灵脂、檀 香、红 花，luteolin、methyl caffeate、palmitic acid、

myristic acid、pentadecylic acid、hordenine、tanwusine、glycine、glutamic acid等218个活性成分，EGFR、TP53、BCL2L1、RELA、ICAM1、PPARG、STAT1、TNF、CASP3、MAPK3、CXCL8、NOS3、IL6、PTGS2等30个靶点，TNF signaling pathway、T cell activation involved in immune response、regulation of acute inflammatory response、response to interleukin-6、NF-kappa B signaling pathway、MAPK signaling pathway、IL-17 signaling pathway、Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor和regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell等20条通路，在输出的网络（图7）中，以不同颜色的节点表示活性成分、靶点以及作用通路，其中：蓝色矩形代表药物，不同颜色的三角形分别代表药物所对应的活性成分，黄色菱形节点代表作用靶点，而三种颜色的圆形代表作用通路，绿色矩形代表药物的功效，橙色矩形代表防治“年仍奈”三个阶段。

图7 “药物-活性成分-靶点-通路-功效”关系网络

3 讨论

自COVID-19发病以来，在新型冠状病毒疾病发展过程中“细胞因子风暴”常导致急性呼吸窘迫脓毒症休克及多器官衰竭状态等加重病情。“免疫-炎症”贯穿COVID-19发病全过程，从初期的免疫细胞应答，或轻症向重症和危重症转变，再或者恢复期，均存在着明显的“免疫-炎症”网络失衡[18]。本研究分析藏药十二味翼首散干预新冠肺炎细胞因子风暴相关的分子生物学基础，也初步探索了藏药治疗“年仍奈”疾病的新思路。

十二味翼首散来源于《藏医医诀补遗》，国药准字为Z63020053，由翼首草、榜嘎（唐古特乌头）、角茴香（节裂角茴香）、莪大夏（镰形棘豆）、黑草乌叶（铁棒锤）、石灰华、牛黄、麝香、安息香、五灵脂膏（渣驯）、白檀香、红花组成，方中重用翼首草以发挥清热解毒，祛风除痹之功效；辅以唐古特乌头清热解毒，生肌收敛，节裂角茴香清热解毒，消炎镇痛，镰形棘豆清热解毒，生肌愈疮，铁棒锤祛寒止痛，祛风定惊，渣驯活血散瘀止痛，白檀香清热消炎，滋补，安息香清热解毒；佐以清热解毒之牛黄和消炎止痛之麝香，以加强除瘟消炎之效；石灰华清热消炎，再配伍清热，活血，滋补之红花，可防止因血病而引起的并发症。其中，翼首草总苷能降低体内IL-1β、TNF-α、IL-17等水平[19]，其抗炎作用可能阻断炎症介质的传递[20-21]；唐古特乌头总碱能显著降低关节炎模型大鼠血清COX-2、IL-1、TNFα等含量[22]；细果角茴香乙醇提取物可能减少肺组织炎症反应和炎性细胞的浸润[23]；莪大夏煎液对巨噬细胞的吞噬功能有促进作用，对细胞免疫具有抑制作用[24]；铁棒锤乌头碱的抗炎作用与中枢及炎症灶内前列腺素含量相关[25]；牛黄能降低急性脑出血后炎症细胞因子TNF-α、IL-6，有效干预炎症细胞因子的瀑布效应[26]；麝香水溶性蛋白对体液免疫和细胞免疫有增强作用[27-28]；五灵脂抗炎作用可能与抑制前列腺素E（PGE）的合成或释放有关[29]等等。

根据藏医学《四部医典》所记载的“年仍奈”的治疗方法，首先是收敛脉窜狭道，其次是结合药物对治诛灭之，第三是清除痼病，驱逐余迹[1]。根据病程变化，发病初期即热病初起阶段，主要呈现未成型热的症状，表现为全身乏力、恶寒、肌肉和关节酸痛、烦躁、昏睡、谵妄、口苦，脉洪盛等[30]，避免不治未熟热或“年”，而直接用寒性药物等，以防止病情恶化，十二味翼首散可能通过黑草乌叶、翼首草、角茴香、牛黄、渣驯等祛风寒、止痛定惊类药物发挥集热平稳作用，人体最原始的免疫反应可能是炎症反应，是免疫反应效应阶段的重要组成部分，我们发现十二味翼首散发挥抗炎的核心靶点为TNF和IL6。TNF是流感细胞因子风暴中心的促炎细胞因子，大量TNF-α易刺激白细胞浸润，可能诱导细胞因子、趋化因子、黏附分子等生成[31-32]，引发过度的炎症反应亦能加重冠状病毒的致病性[33]；IL-6作为临床上公认诊断肺部感染的实验室指标，是造成细胞因子风暴的典型促炎因子[34]。随着疾病中期时疫扩展或增盛热，正邪相争出现身体沉重，汗臭难闻，舌唇牙齿皆积垢，头痛，烦躁等症状，热症催熟后犹如燃料已尽之火，此时削弱瘟热，正是清热症的关键时刻[2]，利用网络药理学技术结合文献分析，免疫系统被认为是机体抗病原体感染的重要防线，当病毒或细菌冲破免疫系统的防线，易致病毒或细菌迅速繁殖，加重细胞因子风暴的发生发展[35]。十二味翼首散防治新冠病毒相关感染涉及朊病毒病（Prion diseases）、人 巨 细 胞 病 毒 感 染（Human cytomegalovirus infection）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor）等，中药抗病毒的途径分为两大类：一类是直接抑制病毒，大多为清热解毒类中药；另一类是调节机体免疫功能，间接发挥抗病毒或抑制病毒介导的炎症反应[36]。清热解毒药能增强机体抗感染免疫能力，抑制变态反应[37]，翼首草、榜嘎、角茴香、安息香、莪大夏、牛黄、麝香、石灰华、红花、白檀香等清热解毒、消炎止痛类药物发挥散热驱邪，抑制传播作用，发挥抗炎、抗菌、抗病毒、提高免疫力等药理作用[38]，涉及CASP3，TNFICAM1，IL6，MAPK1，MAPK14，MAPK3，MAPK8，NFKB1，PTGS2，CXCL8，RELA，STAT1等靶点，参与机体的免疫应答功能和炎症反应，涉及TNF信号通路（TNF signaling pathway）、急性炎症反应的调节（regulation of acute inflammatory response）、白 细 胞 介 素-6的 反 应（response to interleukin-6）、Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、NFκB信 号 通 路（NF-kappa B signaling pathway）等通路。最后溶凝达界呈现空虚状，表现为身体多汗、头晕、倦怠、气短乏力、干呕，延至全身血管和神经可能出现发热、谵妄、口干口苦、尿红而混浊等症状，在这个阶段要以温和法治“隆”为主，不能继续使用寒性药物等，否则消热过度，正精耗损，使热邪复起。新型冠状病毒刺激全身炎症因子风暴，炎症因子启动凋亡途径诱导内皮细胞损伤、死亡和脱落，或者使其表达大量黏附分子，介导炎症细胞黏附和侵入血管壁或血管周围[39]。最初确诊的41例新冠肺炎患者中，重症监护室治疗患者的凝血酶原时间和D-二聚体水平较高[40-41]。十二味翼首散的红花、安息香、榜嘎、莪大夏、渣驯、牛黄、麝香、白檀香等活血生肌、滋补类药物发挥安抚身心，调养身体，防治并发症的防疫作用，本方通过IL6，PTGS2，TGFB1，MAPK1，MAPK14，MAPK3，NOS3，EGFR，FGF2，HMOX1，PPARG，STAT1，TNF等靶点，参与VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、白细胞与血管内皮细胞粘附的调节（regulation of leukocyte adhesion to vascular endothelial cell）、血管内皮生长因子的调节（regulation of vascular endothelial growth factor production）等血管通透及内皮细胞功能发挥改善血流动力学、抗血栓形成、促血管内皮细胞再生及减轻炎症反应等作用，直接或间接干预细胞因子风暴，从侧面角度反映民族医药发挥多靶点、多环节、多通路的网络调控作用。

少数民族医药是我国传统医药和优秀民族文化的重要组成部分[42]，自新冠肺炎疫情爆发以来，少数民族地区结合本民族医药理论、传统经验知识提取应对突发疫情的方药和防治措施，成为中医药防治疫情、维系公众健康的重要参与者。本研究基于网络药理学方法对藏药十二味翼首散抗细胞因子风暴潜在机制的探讨，发现其通过免疫应答功能和炎症反应、病毒感染和血管通透及内皮细胞功能调节相关等信号通 路 调 节TNF、IL6、GAPDH、TP53、MAPK3、ALB、EGFR等核心靶点，发挥了集热平稳、散热驱邪，抑制传播、安抚身心，调养身体等重要作用，上述获取的靶点及通路与文献报道的细胞因子风暴的发病机制有一定的吻合性，用现代分子生物学语言诠释藏药功效原理的科学内涵，为今后开展少数民族医防治突发“年仍奈”疾病的机制研究提供参考。